第一部分获得性放疗耐受——ATM在乳腺癌放疗耐受中的作用和机制研究临床治疗中,放射耐受可分为治疗过程中产生的耐受和肿瘤内在既有的对放射不敏感。肿瘤细胞放疗耐受性的产生,限制了放射治疗在肿瘤治疗中的疗效。在放疗耐受性产生过程中,许多通路的改变起到了重要的作用,如DNA损伤修复机制、细胞自噬等。研究这些通路在放疗耐受发生过程中的作用,揭示放疗耐受性产生的机制,将有助于发现增强放射治疗敏感性的途径,为患者提供更好的治疗。为了模拟临床放疗耐受的条件,我们参照临床乳腺癌放射治疗方案,使用分次、3Gy/次的方式构建了乳腺癌耐放射细胞株MD-PR,并探索了介导耐受性产生的机制。实验通过蛋白印迹、蛋白免疫荧光等方式检测磷酸化组蛋白H2A的表达情况和动态改变,以检测细胞受到放射后细胞修复断裂DNA的效率。通过荧光报告质粒,直观检测DNA修复通路的效率。研究发现,在乳腺癌放疗耐受细胞株中,ATM蛋白水平明显上调。通过使用ATM特异性抑制剂和siRNA干扰ATM表达,研究发现MD-PR细胞通过上调ATM的表达,从而增加双链DNA修复效率,从而促进细胞在受到放射后更好的存活,增强肿瘤细胞的放射耐受性。综上,通过模拟临床治疗方案,我们建立了乳腺癌放射耐受细胞株,并通过与原始细胞株比较,发现了ATM在乳腺癌细胞放疗耐受现象中的作用,提示放射治疗联合靶向ATM抑制,可以为提高肿瘤治疗疗效提供新的可能。第二部分固有放疗耐受——ISG15在胰腺癌放/化疗耐受中的作用和机制通过蛋白质谱分析比较第一部分中乳腺癌耐放射细胞株MD-PR和对照细胞株MD-PB中的蛋白表达差异,我们发现ISG15的表达和肿瘤细胞放射耐受性显著相关。作为类泛素分子,ISG15在机体抗细菌、病毒感染过程中起到重要的作用。同时,尽管机制有待发现,有文章报道ISG15的表达影响细胞自噬。近年来,不断有研究表明ISG15在机体肿瘤的发生、发展、肿瘤免疫和肿瘤治疗中起到重要的作用。结合第一部分的实验结果,在本部分实验中,我们研究了ISG15在本身放射耐受性就较高的胰腺癌中的作用以及相关机制。通过采用组织芯片探讨了胰腺癌组织和癌旁组织中ISG15的表达差异。分析胰腺癌细胞PANC-1和MiaPaca-2中转染ISG15干扰质粒和过表达质粒后对细胞增殖、迁移、侵袭等生物学行为的影响和对放射、化疗药物的敏感性的影响和影响的机制。实验结果表明,在组织芯片中ISG15的表达在胰腺癌组织明显高于癌旁组织,且ISG15的表达和预后相关。敲低ISG15表达后,胰腺癌细胞对放射、化学药物吉西他滨的敏感性增强。进一步实验发现,敲低ISG15表达引起细胞中自噬水平下降,且主要由LC3I/II转化障碍引起。后续实验证明,ISG15主要通过影响ATG7蛋白的稳定性影响细胞的自噬水平。在敲低ISG15的胰腺癌细胞中过表达ISG15可恢复对ATG7的影响并恢复细胞的自噬水平,进一步证实了ISG15通过影响ATG7而调控细胞自噬水平从而影响胰腺癌细胞对放射和化学药物的敏感性。裸鼠皮下成瘤模型进一步证实了ISG15在促进胰腺癌细胞增殖、耐受吉西他滨药物治疗的作用。我们首次证实,ATG7的表达水平受到ISG15的调控。本研究阐明了ISG15在胰腺癌放疗、化疗耐受中的作用和机制。