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硫酸软骨素(Chondroitin,CS)是一种由D-葡萄糖醛酸残基(GlacA)及N-乙酰半乳糖胺(GalNac)残基线性交替组成的糖胺聚糖,在动物的软骨组织中大量存在。由于具有较好的生物相容性及生物可降解性,这种带负电荷的糖胺聚糖常与其他药物偶联成为聚合物-药物结合物,偶联后的结合物可以增强药物的生物活性及稳定性,降低其细胞毒性,延长在体内的半衰期。另外,硫酸软骨素也是CD44受体的配体,药物与硫酸软骨素相连形成结合物后,具有潜在的主动靶向CD44受体的能力。内皮抑素(Endostatin,ES)是一种内源性的多肽,分子量为20kDa,具有抗新生血管生成活性,来源于鼠血管内皮细胞瘤。ES发挥抗肿瘤作用的机制是抑制肿瘤组织附近新生血管的生成,从而切断肿瘤的营养供给途径及代谢途径。ES2(IVRRADRAAVP)是ES中的一段短肽,体内抗新生血管生成活性约为ES的三倍。Anti-Fltl(AF)是一种来源于合成肽组合文库中的多肽,这种多肽可以与VEGF-R1相结合从而特异性抑制VEGF-R1与其配体相结合。通过多肽固相合成技术,我们将多肽ES2与多肽AF借助连接链(GGGG)相连并合成了一种新型的抗新生血管生成肽ES2-AF。然而多肽ES2-AF的生物活性受其血浆半衰期较短的因素限制,频繁给药降低了患者的顺从性并增加了治疗费用。本研究使用化学修饰的方法将硫酸软骨素与ES2-AF多肽相连,增加了多肽的稳定性及靶向CD44受体的作用。本文主要研究内容如下:1.ES2-AF及CS-ES2-AF的合称及表征通过固相合成的方法合成新型的多肽ES2-linker(GGGG)-AF,采用制备液相进行纯化,多肽纯度约为95.14%。质谱结果显示分子量与理论值相同。为增加CS在有机溶剂中的溶解度,采用离子交换法制备硫酸软骨素的四丁基氢氧化铵盐(CS-TBA)。在随后的制备反应过程中,借助卡特缩合试剂(Benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophophate castros reagent,BOP)及试剂 N,N-二异丙基乙胺(N,N-diisopropylethylamine,DIPEA)的活化作用使CS-TBA与ES2-AF发生偶联反应制备CS-ES2-AF。并以一维核磁共振氢谱(1H nuclear resonance spectroscopy,1H-NMR)方式对CS-ES2-AF进行结构确证。通过1H-NMR数据的曲线下面积积分结果,确定每条CS链上平均连接2个ES2-AF多肽。2.ES2-AF及CS-ES2-AF的体内外活性研究(1)使用MTT法研究ES2-AF及CS-ES2-AF在体外对血管内皮细胞的抑制作用。两种药物对内皮细胞的抑制作用均呈浓度依赖性,当ES2-AF的浓度达到200 μg/mL时,CS-ES2-AF表现出明显优于ES2-AF的抑制作用。(2)采用划痕法研究CS-ES2-AF及ES2-AF对内皮细胞迁移的抑制作用。实验结果显示ES2-AF、CS与ES2-AF的物理混合物及CS-ES2-AF均可抑制内皮细胞的迁移运动,当ES2-AF浓度为50～200μg/mL时,结合物CS-ES2-AF的活性明显优于其他两个实验组。另外,所有实验组的抑制作用均呈浓度依赖性。(3)通过体外管腔形成抑制实验评价ES2-AF、CS&ES2-AF、CS-ES2-AF抑制内皮细胞形成管腔的能力。当ES2-AF的浓度相同时,结合物CS-ES2-AF抑制内皮细胞形成管腔的作用较未经修饰的多肽ES2-AF显著提高。(4)借助鸡胚绒毛膜尿囊膜实验法(Chick chorioallantoic membrane,CAM)研究ES2-AF及CS-ES2-AF在生物体内抑制新生血管生成的活性。实验结果显示,当 ES2-AF 浓度为 10 μg/mL 及 25 μg/mL 时,CS-ES2-AF 的活性与 ES2-AF无明显差异,;当ES2-AF浓度达到50μg/mL时,结合物CS-ES2-AF的活性才明显的强于ES2-AF。3.CS-ES2-AF的靶向性研究(1)使用酶联免疫法吸附测定法(ELISA法)评价药物抑制VEGF与其受体VEGF-R1结合的能力。所有实验组均有抑制VEGF与VEGF-R1受体结合的能力,且呈浓度依赖性。与ES2-AF组相比,相同浓度的CS&ES2-AF及CS-ES2-AF抑制VEGF与其受体结合的能力明显增强,且CS-ES2-AF与ES2-AF的组间差异具有统计学意义(p<0.01)。(2)采用表面等离子共振技术(Surface plasmon resonance,SPR)研究ES2-AF与CS-ES2-AF靶向CD44受体的能力。首先筛选了适宜的pH值使CD44蛋白连在CM5芯片上,当pH值为3.8时,CD44蛋白连接于芯片上产生的响应值最大,在此条件下进行偶联反应,蛋白最终偶联量为394.8RU。分别将不同浓度的样品溶液流经CM5芯片进行并对分析物与CD44蛋白之间的亲和力进行检测,测得CS-ES2-AF及ES2-AF的平衡解离常数(KD)分别为9.895×10-9及3.01 1×10-4。实验数据表明结合物CS-ES2-AF增强了原有多肽靶向CD44受体的能力。(3)通过小动物实时活体成像技术可动态观察具有荧光标记的ES2-AF-FITC及CS-ES2-AF-FITC在荷瘤裸鼠体内的分布情况。首先使用异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)标记 ES2-AF 及 CS-ES2-AF,并采用尾静脉注射给药的方式对荷瘤裸鼠进行给药,并通过小动物活体成像仪进行观察。相比于ES2-AF,CS-ES2-AF表现出较长的半衰期及一定的肿瘤靶向性。4.ES2-AF及CS-ES2-AF的药代动力学研究通过荧光酶标仪以荧光分光光度法测定ES2-AF及CS-ES2-AF的浓度,该方法符合生物样本测定方法学的要求。以腹腔注射方式分别给balb/c小鼠注射20mg/kg的药物。通过对ES2-AF及CS-ES2-AF的药代动力学参数进行分析,CS-ES2-AF组在小鼠体内的循环时间明显延长,意味着CS-ES2-AF在小鼠血浆内的稳定性优于ES2-AF。在本研究中,成功制备了硫酸软骨素化的抑制新生血管生成肽结合物CS-ES2-AF,并以1H-NMR方式进行结构表征。通过一系列生物活性实验,结合物CS-ES2-AF表现出显著的生物活性,且具有主动靶向性及较长的血浆半衰期。采用硫酸软骨素修饰ES2-AF可显著增强其抗新生血管生成活性并减少给药次数,这在未来的临床应用中有良好的潜力。