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本研究针对SGIV特异核酸序列,建立了一种简单、快速、敏感而且特异性高的检测SGIV的环介导恒温扩增方法(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)。针对SGIV ORF-014L设计了6条特异性LAMP引物,构建重组质粒p17-014L作为检测标准样品,利用Bst DNApolymerase大片段在20 min 650C温育条件下扩增重组质粒DNA;可以通过三种方法判断反应结果。LAMP检测其他7种与SGIV近缘或远缘的病毒无交叉反应,表明检测特异性强;检测灵敏度为0.02fg质粒DNA(相当于6.3拷贝病毒基因组DNA)。应用该方法成功检测感染细胞以及鱼组织中的SGIV,并有潜力应用于野外检测。
本研究通过纯化病毒SGIV,用Triton X-100处理纯病毒并采用SDS-9PAGE成功分离囊膜和核衣壳。通过MALDI-TOF-MS/MS鉴定分离的囊膜蛋白,初步发现9个病毒编码的蛋白和5个宿主编码的蛋白。其中病毒编码的蛋白包含3个虹彩病毒科核心基因编码的蛋白;宿主编码的蛋白是病毒诱导胁迫蛋白、类似核糖体结合蛋白、离子通道蛋白、发动蛋白、类似血影蛋白,我们推测这些蛋白可能是整合于病毒囊膜的宿主蛋白,它们有可能在病毒感染细胞、内吞以及组装等复制和增殖过程中起重要作用。对囊膜蛋白的深入研究有利于发现与阐明虹彩病毒囊膜蛋白的生物学功能,并为研究病毒的防治提供理论依据。我们进一步对囊膜蛋白VP088进行深入研究。从SGIV基因组中克隆了ORF088L,应用生物信息学分析软件对ORF088L基因进行序列分析。发现SGIV ORF088L编码的VP088是一个虹彩病毒科保守的病毒蛋白,该蛋白具有跨膜结构、糖蛋白修饰、RGD结构域等信息,提示VP088可能是一个病毒表面跨膜蛋白,并且有可能参与病毒黏附和感染宿主细胞。
应用RT-PCR方法,通过体外细胞培养与感染后转录分析表明,SGIV VP088基因的转录从SGIV感染细胞后12h开始,基因表达量在48h达到最大。VP088的转录时序与MCP相似,药物抑制实验表明该基因是一个晚期基因。我们进一步构建了融合蛋白表达载体pET-VP088,并成功地在原核细胞E.coli BL21(DE3)中经IPTG诱导下高效表达了重组融合蛋白,并用纯化的融合蛋白作为抗原,免疫BALB/cA小鼠制备抗血清,经过Western-blot实验证明’VP088蛋白确实存在于病毒囊膜组分中。免疫电镜实验进一步直观证明了VP088定位于病毒囊膜。
本研究对囊膜蛋白VP088的功能进行了初步研究。采用间接免疫荧光观察到VP088黏附于GP细胞表面,VP088可能具有介导病毒黏附宿主细胞的功能;病毒覆盖蛋白结合实验(VOPBA)发现GP细胞膜上有VP088特异性结合的蛋白,可能是VP088细胞表面受体蛋白;发现重组VP088能竞争性抑制病毒感染宿主GP细胞,说明SGIV有可能通过囊膜蛋白VP088黏附宿主,进而感染宿主细胞:抗体中和实验表明,小鼠抗VP088血清能够部分中和病毒对GP细胞的感染,并且能够延缓病毒的增殖复制过程,这证明囊膜蛋白VP088与病毒感染宿主细胞相关。