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目的:1.验证miR-222-3p和Ddit4基因在小鼠胚胎脑组织正常组和ATRA畸形组miRNA-Seq中的表达情况;验证miR-222-3p的靶基因是Ddit4。2.观察miR-222-3p低表达对HT-22细胞功能的影响,初步确定miR-222-3p对细胞功能的作用。3.通过干扰Ddit4表达观察miR-222-3p对Wnt信号通路及HT-22细胞功能的影响,初步探索miR-222-3p在ATRA诱导的小鼠胚胎NTDs发生过程中的作用机制。方法:1.建立小鼠胚胎NTDs模型:通过灌胃给药的方式,在C57BL/6小鼠怀孕第7.5天（E7.5）,将全反式维甲酸（ATRA）按照28 mg/Kg的剂量注入孕鼠体内,建立胚胎神经管畸形（NTDs）模型,然后继续饲养至E8.5、E9.5和E10.5时分别提取胚胎脑组织。2.验证异常表达的microRNA和基因及两者之间的关系:通过实时定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测正常和畸形胚胎脑组织E8.5、E9.5和E10.5 miR-222-3p和Ddit4 mRNA水平的表达情况;通过双荧光素酶报告基因技术检测miR-222-3p的靶基因;并通过脂质体分别将化学合成的miR-222-3p模拟物（mim-222）和miR-222-3p抑制剂（Anti-222）转染进HT-22细胞;并通过Real-time PCR、蛋白印迹（Western blotting）技术检测下游靶基因Ddit4的表达。3.检测干扰miR-222-3p表达后的细胞表型变化:通过脂质体将化学合成的Anti-222转染进HT-22细胞,进而检测细胞增殖（CCK-8法、Western blotting）、凋亡（流式细胞术、AO-EB、Western blotting）、细胞周期（流式细胞术）及迁移（细胞划痕实验）水平变化,实验分为三组:Con组（未加处理的HT-22细胞）、Anti-NC组（转染空载体的HT-22细胞）、Anti-222组（miR-222-3p抑制剂转染HT-22细胞）。4.检测miR-222-3p下游基因对细胞表型的影响:通过脂质体将化学合成的Ddit4小干扰RNA（siR-Ddit4）转染进HT-22细胞干扰Ddit4表达,进行细胞增殖、凋亡、周期和划痕实验。实验分为三组:Anti-NC组（转染空载体的HT-22细胞）、Anti-222组（miR-222-3p抑制剂转染HT-22细胞）和Anti-222+siR-Ddit4组（miR-222-3p抑制剂和siRNA-Ddit4共转染HT-22细胞）。5.检测Wnt信号通路相关指标的表达情况:通过Real-time PCR检测Wnt信号通路指标β-catenin、TCF4表达的变化;通过Western blotting检测Wnt信号通路指标标志蛋白β-catenin、TCF4蛋白的表达变化及下游指标C-myc、CycinD1蛋白的表达。6.统计学分析方法:用均数±标准差（X±S）表示数据,SPSS17.0软件进行统计学分析,GraphPad Prism 8软件进行数据作图,Image-J软件进行灰度值分析采用t检验比较两个样本均数间差异。*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001,当P<0.05差异具有统计学意义。结果:1.通过28 mg/kg全反式维甲酸灌胃,建立C57BL/6小鼠胚胎NTDs模型。采用Real-time PCR技术检测E8.5-E10.5脑组织miR-222-3p mRNA的水平变化,其中miR-222-3p在RA组表达较Con组明显降低（P<0.001）;Ddit4在RA组表达较Con组明显升高（P<0.01）;实验数据与miR-seq结果相一致。2.前期通过Targetscan、PicTar、miRanda生物信息学软件分析发现miR-222-3p的靶基因是Ddit4;双荧光素酶报告基因技术发现野生型Ddit4载体与miR-222-3p结合后双荧光素酶活性下降（P<0.001）,而突变型Ddit4载体与miR-222-3p结合后双荧光素酶活性无变化,说明miR-222-3p的下游靶基因是Ddit4;通过荧光显微镜和流式细胞术检测转染效率达到80%以上,检测转染后Ddit4的表达水平变化,Ddit4在Anti-222组表达较Con组和Anti-NC组表达显著升高（P<0.001）,在mim-222组表达较Con组和mim-NC组表达显著降低（P<0.01）。3.细胞增殖结果显示:CCK-8法结果表明Anti-NC组、Anti-222组0 h时的吸光度值（OD）与Con组无明显差异,转染后的2-4天,Anti-222组OD值显著低于Con组和Anti-NC组（P<0.01）;Anti-222+siR-Ddit4组OD值显著高于Anti-222组（P<0.01）;Western blotting结果表明Anti-222组PCNA蛋白表达水平降低（P<0.001）;Anti-222+siR-Ddit4组PCNA蛋白表达水平较Anti-222升高（P<0.05）。4.细胞凋亡结果显示:流式结果表明Anti-222组细胞的早凋率和晚凋率显著高于Con和Anti-NC组（P<0.001）;Anti-222+siR-Ddit4组细胞的早凋率和晚凋率显著低于Anti-222组（P<0.001）;AO-EB结果表明:Anti-222中绿色和橘红色并呈固缩状或圆珠状的早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞显著多于Con组和Anti-NC组（P<0.001）;Western blotting结果表明Anti-222组Cleaved Caspase-3蛋白表达水平显著升高（P<0.001）;Anti-222+siR-Ddit4组PCNA蛋白表达水平较Anti-222组显著降低（P<0.001）。5.细胞周期结果显示:流式结果表明Anti-222组处于G1期的细胞数显著高于Con和Anti-NC组,而处于S和G2期的细胞数,显著低于Con和Anti-NC组(PG1<0.001,PS<0.001);Anti-222+siR-Ddit4组处于G1期的细胞数显著低于Anti-222组,处于S和G2期的细胞数显著高于Anti-222组(PG1<0.001,PS<0.001)。6.细胞迁移结果显示:细胞划痕结果表明Anti-222组较Con和Anti-NC组细胞迁移能力显著降低（P<0.001）;Anti-222+siR-Ddit4组迁移能力较Anti-222显著增强（P<0.001）。7.Real-time PCR结果显示:Anti-222组与Con组及Anti-NC组相比,β-catenin、TCF4 mRNA表达显著降低（P<0.001）;Anti-222+siR-Ddit4组较Anti-222组表达显著升高（P<0.05）。8.Western blotting结果显示:Anti-222组与Con组及Anti-NC组相比,β-catenin、TCF4、C-myc、CycinD1蛋白水平表达显著降低（P<0.01）;Anti-222+siR-Ddit4组较Anti-222组表达显著升高（P<0.001）。结论:1.miR-222-3p低表达可能在ATRA诱导的NTDs发生过程中起重要作用。2.miR-222-3p的靶基因是Ddit4。3.miR-222-3p可能通过影响Ddit4表达参与Wnt信号通路引起细胞增殖和细胞凋亡、细胞迁移的异常而造成NTDs的发生。