研究背景和目的:结直肠癌是全球最常见的消化道恶性肿瘤之一,发病率和肿瘤相关死亡率在所有恶性肿瘤中位居第三位。近年来,随着人们生活方式和饮食结构的转变,世界范围内的结直肠癌发病率呈逐年上升趋势,同时发病年龄亦呈年轻化的特点。肿瘤侵袭和转移是造成结直肠癌病人死亡的主要原因。结直肠癌发生后可以向周围网膜组织侵袭,破坏正常的组织和器官;同时中晚期患者可发生淋巴道和血道转移,肝脏是结直肠癌转移的主要靶器官,结直肠癌肝转移是临床上根治性手术失败的主要原因。结直肠癌的发生是一个多步骤的和多基因突变的复杂过程,在此过程中常常伴有癌基因的激活、抑癌基因的失活、凋亡调节基因和DNA修复基因的改变等。但是,在分子遗传学水平,目前尚未发现一个单独的、直接负责调控肿瘤细胞增殖或转移的基因。结直肠癌侵袭和转移的机制也十分复杂,是一个涉及癌细胞和宿主两方面的一系列、多步骤的生物学过程。细胞间粘附性下降、细胞自身运动能力增强、细胞内骨架改变、EMT、肿瘤微环境的变化、炎症因子、血管生成以及肿瘤细胞分泌囊泡的异常等在转移的过程中均发挥着重要的作用。鉴于此,深入研究结直肠癌的发生、发展及侵袭和转移的机制,对开发有效的治疗措施、改善结直肠癌患者的生存质量、提高患者的生存率均具有重要的临床价值和社会效益。SAFB(Scaffold attachment factor-B)是一种核基质结合因子,属于核蛋白家族,位于19号染色体19p13.3,定位于核基质中,在人体组织中广泛表达。SAFB参与机体内多种细胞生物学过程,包括RNA转录后加工、细胞增殖、细胞应激反应、细胞凋亡以及基因的转录调控等。研究显示,SAFB通过N端DNA结合域(SAP/SAF-BOX)和C-端的转录抑制结构域直接或者间接与基因启动子相结合,抑制相关基因转录。鉴于SAFB上述的生物学功能,如果SAFB表达降低,可能会引起被调控的肿瘤相关癌基因表达上调,同时细胞增殖能力增强,凋亡数量减少,引起细胞永生化和恶性转化,最终可以导致恶性肿瘤的发生和发展。相关研究显示SAFB主要参与激素相关肿瘤,包括乳腺癌和前列腺癌的发生、发展和转移。本课题的前期研究结果显示SAFB在结直肠癌以及淋巴结转移癌中的表达水平显著低于正常对照结直肠组织,但是SAFB在结直肠癌发生、发展、侵袭和转移过程中的作用、相关分子机制及表达调控均尚不完全清楚。本课题拟检测SAFB在结直肠癌中的表达情况,分析SAFB表达水平与临床病理参数的关系;研究SAFB在结直肠癌侵袭和转移过程中的作用及相关分子机制;探讨SAFB异常表达的上游调控机制。方法:1.利用公共数据库数据(Oncomine数据库和GEO数据库)分析SAFB在结直肠癌及其他恶性肿瘤中的表达情况及临床意义;2.利用免疫组织化学(IHC)、免疫印迹(westernblot)和荧光实时定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-PCR)检测结直肠癌石蜡样本和新鲜配对组织样本中SAFB的表达情况,分析SAFB的表达与肿瘤分化、分期、转移和预后等临床病理参数的关系;3.利用公共数据库(GEO数据库等),通过GSEA基因富集及GO分析的方法检测SAFB低表达芯片数据中NF-κB信号通路的富集情况;4.建立SAFB稳定过表达和干扰的结直肠癌细胞株,通过双荧光素酶活性检测实验验证SAFB对NF-κB信号通路活性的影响,通过核浆蛋白分离、免疫荧光实验验证SAFB对p65入核的影响,通过westemblot和RT-PCR实验验证SAFB对TAK1表达的影响,通过染色体免疫共沉淀(ChIP)、启动子活性检测实验检测和验证SAFB对TAK1启动子特异性位点的结合和转录抑制作用;5.通过核浆分离和westernblot实验检测SAFB通过靶向TAK1对p65入核情况的影响;6.在稳定过表达和干扰SAFB的结直肠癌细胞株中再过表达或干扰TAK1,通过软琼脂集落形成实验检测细胞的非依赖性生长能力,通过体外侵袭实验检测细胞的侵袭迁移能力,通过鸡胚尿囊膜血管生成实验(chrioallantoic membrane,CAM)、人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)小管生成实验及裸鼠皮下瘤实验检测体内外血管的生成情况,通过结直肠癌细胞裸鼠原位种植实验(surgical orthotopic implantation,SOI)检测肿瘤细胞的转移能力;7.利用在线分析软件“cBioPortal for Cancer Genomics”分析公共数据库数据中结直肠癌和其他恶性肿瘤中SAFB的缺失及突变情况;8.利用TargetScan等软件预测、GEO芯片数据库筛选出既在结直肠癌中表达上调又可以作用于SAFB的microRNAs;9.通过Westermblot、RT-PCR方法验证miR-183对SAFB表达的调控;10.利用双荧光素酶报告基因实验验证miR-183对SAFB 3’-UTR区的调控作用;11.利用IHC、westernblot和RT-PCR分析结直肠癌石蜡样本和新鲜结直肠癌组织样本中 SAFB 与 TAK1、miR-183、MMP9、IL6、IL8 及 VEGF 的表达相关性。结果:(数据使用SPSS 20.0 for Windows统计软件进行分析)1.SAFB在结直肠癌及其他恶性肿瘤中的表达及临床意义1)公共数据库中SAFB在结直肠癌和其他恶性肿瘤中的表达情况及临床意义Oncomine在线软件分析结果显示,在734个芯片数据库中,符合入选标准且SAFB表达下调的数据库有124个,SAFB表达上调的有52个,其中在11个结直肠癌芯片数据库中有8个SAFB表达下调,3个SAFB表达上调。GSEA基因富集分析显示,在结直肠癌组织表达谱芯片GSE13294和GSE35896数据中,结直肠癌相关基因集“KEGG_COLORECTAL CANCER”中的基因在SAFB 低表达组中出现显著的富集(GSE13294 NES=2.01,P<0.001;GSE35896 NES=1.57,P<0.001);Kaplan-Meier法分析了 SAFB高表达组和低表达组的生存曲线,结果显示,两个数据库中,SAFB高表达组10年生存率分别为为72.8%和77.5%,而低表达组仅为64.7%和60.2%,两个数据库中SAFB高表达组的总体生存率均高于低表达组(Log-Rank,GSE39582χ2=4.842,P=0.028;GSE17538χ2=5.213,P=0.022),并且随着SAFB表达的减弱,总体生存曲线逐渐下降(图1-3)。2)结直肠癌组织中SAFB表达水平的检测westernblot和RT-PCR结果显示肿瘤组织中SAFB的蛋白和mRNA表达水平均低于相配对的癌旁正常组织(P<0.05);IHC结果显示SAFB阳性表达主要定位于细胞核,呈棕红色或黄褐色,SAFB蛋白表达水平在肿瘤组织中显著低于相配对的癌旁正常组织,并且随着肿瘤分化程度的降低,SAFB的表达水平亦明显下降。3)SAFB的表达水平与临床病理参数之间的关系IPP软件和半定量方法分析的结果显示,SAFB的表达水平在不同年龄组、不同性别之间没有显著差异(P>0.05);SAFB的表达水平在不同分化程度的结直肠癌之间的差异具有统计学意义,并且随着分化程度的降低而下降(P<0.05);SAFB的表达水平与Dukes分期、TNM分期及转移呈负相关关系,随着结直肠癌细胞浸润深度(T)、淋巴结转移数量(N)和远处转移部位(M)的增加,SAFB的表达水平逐渐下降(P<0.05)。Kaplan-Meier法分析结果显示,SAFB高表达组5年生存率为68.4%,而低表达组仅为53.1%,高表达组的总体生存率显著高于低表达组,差异有统计学意义(Log-Rank,χ2=4.615,P=0.032)。2.结直肠癌中SAFB对NF-κB信号通路的调节作用1)利用生物信息学分析SAFB低表达对NF-κB信号通路活性的影响GSEA基因富集分析显示,在结直肠癌组织表达谱芯片GSE13294和GSE35896 数据中,NF-κB 信号通路相关基因集“BIOCARTA_NFKB_PATHWAY”中的基因在SAFB低表达组中出现上调并显著富集(P<0.001);在乳腺癌细胞株MCF-7 SAFB干扰及其对照组的全基因组表达谱芯片GSE15548数据中,多个NF-κB信号通路相关基因集在SAFB低表达组中均出现NF-κB信号通路相关基因的上调并显著富集(P<0.001);对GSE15548基因芯片结果进行差异基因的GO(Gene Ontology)分析,结果显示,SAFB表达下调时,参与转录激活、MAP相关激酶的磷酸化,特别是能与NF-κB结合的相关基因均出现显著上调。2)构建SAFB过表达和干扰病毒载体,建立稳定表达细胞株利用分子克隆技术构建了 SAFB过表达和干扰的病毒表达载体,测序结果显示插入的序列正确,无突变、缺失或者框移。利用慢病毒和逆转录病毒载体分别构建了 SAFB稳定过表达和干扰的结直肠癌细胞株,并通过westernblot实验进行了验证。3)结直肠癌细胞中SAFB低表达对NF-κB信号通路活性影响的验证双荧光素酶报告基因实验结果显示,与对照组相比,在结直肠癌细胞中过表达SAFB后,NF-κB的荧光素酶活性降低(t=8.233,P=0.001),表明NF-κB转录活性下降;相反,干扰SAFB后NF-κB的荧光素酶活性增高,NF-κB转录活性增强(F=99.007,P<0.001)。核浆蛋白分离和免疫荧光染色实验结果显示,过表达SAFB的细胞中,p65入核减少,p65在细胞核中表达水平下降,而在细胞浆中表达上升;而干扰SAFB后,P65出现了明显的核内聚集现象,细胞核中P65的表达水平上升。Westernblot检测结果显示,与对照组细胞相比,过表达SAFB之后,p-p65、p-IKKβ和p-IκBα表达均显著下降,而总的p65、IκBα及IKK的表达未发生明显变化;相反,干扰SAFB后,p-p65及其上游的p-IκBα和p-IKKβ表达均显著增加,总的p65及IKK的表达未发生明显变化,而总IκBα表达略有下降。4)TAK1在SAFB调控NF-κB信号通路活性中的作用RT-PCR实验和热图分析结果显示NF-κB信号通路中的多个基因在SAFB干扰后的细胞株中表达显著上调,包括TAK1、IL-6、IL-8、MMP9、TNF、CXCL10等,westernblot结果显示,调控IKK磷酸化的上游分子TAK1在SAFB被干扰后表达显著上调,相反,SAFB的过表达则明显抑制TAK1的表达。双荧光素酶报告基因实验结果显示,在结直肠癌细胞中同时过表达SAFB和TAK1后,NF-κB的荧光素酶活性较单独SAFB过表达组显著升高(P<0.01),而同时干扰SAFB和TAK1后,NF-κB的荧光素酶活性又较单独SAFB干扰组显著降低(P<0.01),表达水平接近转染空载体对照细胞(P>0.05),另外我们用TAK1的抑制剂5Z-7-oxozeaenol处理细胞抑制TAK1的活性,结果显示与应用TAK1 siRNA干扰TAK1后得到的结果相一致。核浆分离后westernblot实验结果显示在过表达SAFB的结直肠癌细胞株中再过表达TAK1后,p65的入核明显较单独SAFB过表达组增加;在干扰SAFB后再干扰TAK1的表达,p65的入核明显又较单独SAFB干扰组显著减少,而用TAK1抑制剂5Z-7-oxozeaenol处理细胞抑制TAK1的活化,结果显示与siRNA干扰TAK1后结果相一致。5)SAFB对TAK1基因转录的抑制作用染色质免疫共沉淀实验(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)结果显示,SAFB可以与TAK1启动子区第一个E-box盒(P1),即-505 bp～-510 bp位点特异性结合(t=-5.340,P=0.006)。双荧光素酶活性报告实验结果显示,在结直肠癌细胞SW480和HCT15中,干扰SAFB后TAK1的启动子活性显著升高(t=-9.995,P=0.001;t=-17.223,PP<0.001),而将 P1 位点突变后,干扰SAFB后则不能再影响TAK1的启动子活性(P>0.05)。3.SAFB-TAK1-NF-κB通路对结直肠癌细胞侵袭和转移能力的影响1)SAFB-TAK1-NF-κB通路对结直肠癌细胞非依赖性生长能力的影响软琼脂克隆形成实验结果显示,与对照组相比,稳定过表达SAFB的结直肠癌细胞株克隆形成数量明显减少(P<0.01),而在细胞中同时过表达TAK1时,克隆形成数量与对照组没有明显差异(P>0.05,);干扰SAFB后的细胞株克隆形成的数量则显著多于对照组(P<0.01),而用siRNA干扰TAK1或TAK1抑制剂5Z-7-oxozeaenol处理后,克隆形成的数量又显著减少,接近对照组克隆形成数目(P>0.05)。2)SAFB-TAK1-NF-κB通路对结直肠癌细胞侵袭能力的影响Transwell小室侵袭实验结果显示,与对照组相比,稳定过表达SAFB的细胞株迁移细胞的数量明显减少(P<0.01),而在细胞中同时过表达TAK1后,细胞的侵袭和迁移能力较单独SAFB过表达组又显著增加(P<0.01);干扰SAFB后的细胞株迁移细胞的数量则显著多于对照组(P<0.01),同样用siRNA干扰TAK1或TAK1抑制剂5Z-7-oxozeaenol处理后,细胞的侵袭和迁移能力较单独SAFB干扰组又显著减弱(P<0.01)。3)SAFB-TAK1-NF-κB通路对体内外血管生成的影响鸡胚尿囊膜血管生成实验、人脐静脉内皮细胞小管生成实验和裸鼠皮下成瘤实验结果显示,与对照组相比,稳定过表达SAFB可以明显抑制体内外的血管生成(P<0.01),而在SAFB稳定过表达细胞中同时过表达TAK1对血管生成的抑制作较单独SAFB过表达组又明显减弱(P<0.01);稳定干扰SAFB则可以明显促进体内外的血管生成(P<0.01),同样用siRNA干扰TAK1或TAK1抑制剂5Z-7-oxozeaenol处理后,对血管的促生成能力较单独SAFB干扰组又显著减弱(P<0.01)。4)SAFB-TAK1-NF-κB通路体内结直肠癌细胞迁移能力的影响裸鼠原位种植实验结果显示,与对照组相比,稳定过表达SAFB后,裸鼠肠段及肝内转移瘤出现率及形成转移瘤结节数目均显著降低(P<0.01),而在细胞中同时过表达TAK1后,裸鼠肠段及肝内转移瘤出现率及形成转移瘤结节数较单独SAFB过表达组又明显增多(P<0.05);干扰SAFB表达后,裸鼠肠段发生多个转移癌结节,并且肝表面转移灶的出现率及出现个数均较对照组显著增多(P<0.05),H&E切片显示,肝内有多个微小转移灶,而用siRNA干扰TAK1或TAK1抑制剂5Z-7-oxozeaenol处理后,肿瘤细胞在裸鼠肠段及肝内形成转移瘤出现率及转移结节数目又较单独SAFB干扰组又显著降低(P<0.05)。4.结直肠癌中SAFB表达的上游调控机制1)SAFB基因在结直肠癌中缺失和突变情况的分析生物信息学分析结果显示,在 Gennentech(Nature 2012)、TCGA(Nature 2012)和TCGA(Provisional)三个结直肠癌数据库分别含有72例、212例和220例结直肠癌样本,分析结果发现SAFB的突变率分别为2.8%(2/72)、1.4%(3/212)和 1.4%(3/220);缺失率分别为 0%(0/72)、0%(0/212)和 0.5%(1/220);扩增率分别为 0%(0/72)、0.9%(2/212)和 0%(0/220)。2)结直肠癌中调控SAFB表达的microRNAs的筛选TargetScan等在线软件筛选结果显示,miR-183可以作用于SAFB 3’-UTR区的特异性位点,且该位点序列在人和多个物种中均高度保守。GEO芯片数据库数据分析结果显示,在3个结直肠癌的microRNAs芯片数据的交集中共有8个表达上调的microRNAs,其中包括miR-183。3)miR-183对SAFB表达的调控作用RT-PCR和westernblot结果显示,与对照组(NC)相比,用miR-183的模拟物(mimics)处理结直肠癌细胞后,SAFB的表达下降(F=85.061,P<0.001),而用miR-183抑制剂(inhibitor)处理后SAFB的表达上调,并且呈剂量依赖关系(F=178.332,P<0.001)。4)miR-183调控SAFB表达的分子机制双荧光素酶活性报告实验结果显示,共转染重组质粒pGL3-SAFB 3’-UTR和miR-183 NC 或 miR-183 mimics 后,SAFB 的荧光素酶活性随 miR-183 mimics转染量的增加而显著降低(F=133.982,P<0.001;F=694.590,P<0.001);共转染 pGL3-SAFB 3’-UTR 和 miR-183 NC 或 miR-183 inhibitor 后,SAFB 的荧光素酶活性显著增强(F=45.031,P<0.001;F=145.882,P<0.001),并同样呈剂量依赖性;而在转染miR-183 NC和miR-183 mimics的细胞内,突变miR-183在SAFB 3’-UTR区特异性结合位点后,miR-183的过表达则不再影响SAFB的荧光素酶活性(P>0.05)。5.SAFB与TAK1、miR-183在结直肠癌组织中的表达相关性1)结直肠癌组织芯片样本中SAFB和TAK1的表达情况IHC结果显示,93.59%(73/78)的结直肠癌样本为SAFB低表达,而2例癌旁肠黏膜样本中TAK1基本不表达,SAFB均为高表达;其中73例SAFB低表达的结肠癌中TAK1高表达有52例,而在5例SAFB中高表达组中有4例为TAK1低表达,即在78例结直肠癌中SAFB的阳性表达率明显低于TAK1(p<0.001)。2)结直肠癌样本中SAFB和TAK1蛋白水平的表达Westernblot结果显示,在10对新鲜组织中,肿瘤中的SAFB蛋白表达水平均显著低于配对的正常肠粘膜组织,而对应样本中TAK1蛋白的在肿瘤中则明显高于正常肠粘膜组织。3)结直肠癌样本中SAFB、TAK1和miR-183三者mRNA水平的表达的相关性RT-PCR检测及Spearman相关分析结果显示,在10例肿瘤组织中SAFB与TAK1(r =-0.682,P=0.030)和 miR-183(r =-0.680,P=0.030)的 mRNA 水平的表达水平均呈显著的负性相关关系。4)结直肠癌样本中SAFB与MMP9、IL6、IL8及VEGF的表达相关性RT-PCR检测及Spearman相关分析结果显示,在10例结直肠癌组织中,SAFB与 MMP9(r =-0.743,P=0.014)、IL6(r =-0.723,P=0.018)、IL8(r=-0.637,P=0.047)及VEGF(r =-0.724,P=0.018)的mRNA水平的表达水平均呈显著的负性相关关系。结论:1.结直肠癌组织中SAFB表达水平显著下调;SAFB的表达水平与结直肠癌的分化、Dukes分期、TNM分期、转移和预后等临床病理参数间呈负相关关系;2.SAFB通过靶向TAK1调控NF-κB信号通路的活性,进而调节结直肠癌细胞的侵袭性和转移能力;3.miR-183通过直接靶向SAFB的3’-UTR抑制其表达;4.在结直肠癌患者中SAFB的表达与miR-183、TAK1的表达及NF-κB信号通路下游效应分子MMP9、IL6、IL8及VEGF的表达均呈显著负相关关系。