论文部分内容阅读
研究背景多药耐药（Multidrug resistance,MDR）是临床化疗的主要障碍。近年来,已经研究了一些逆转MDR的化疗策略。然而,由于肿瘤耐药性的产生,导致白血病患者的生存率较低,复发率较高。因此,确定新的治疗白血病的方法和手段仍然是一项挑战。自噬抑制被广泛认为是治疗包括白血病在内的癌症的一种很有前途的治疗策略,但目前仍缺乏有效和特异的自噬抑制剂阻碍了自噬抑制剂的应用。因此,开发新的低毒高效自噬抑制剂具有重要的临床意义。千金藤素（Cepharanthine,CEP）是从中药千金藤根提取的异喹啉生物碱,目前已经用于临床,主要用于升白细胞,并且毒副作用小。在本课题研究中,我们发现CEP能有效地阻断K562/ADR细胞自噬的降解,并能协同多柔比星（Doxorubicin,DOX）抑制K562/ADR细胞增殖和诱导细胞凋亡,进而逆转多药耐药。本论文对CEP协同DOX逆转K562/ADR耐药的分子机制进行深入研究。通过本论文研究,CEP有可能成为一种新型的自噬抑制剂,CEP与DOX等经典化疗药物的协同作用可以作为逆转人类白血病耐药的一种新的治疗策略。研究目的阐明CEP协同DOX逆转K562/ADR细胞耐药的分子机制机制,同时也为CEP联合DOX用于白血病的治疗提供理论依据。研究方法流式细胞仪检测细胞凋亡和ROS;Western Blot（免疫印迹法）检测蛋白表达水平;MTT实验（噻唑蓝法）检测细胞活性。研究内容和结果1.K562/ADR耐药细胞株的鉴定梯度浓度多柔比星均会降低K562与K562/ADR两种细胞存活率,但是多柔比星对K562/ADR细胞IC50更高。相同浓度多柔比星可诱导K562细胞大量凋亡而对K562/ADR细胞无明显影响。多药耐药标志蛋白Mdr-1在K562/ADR细胞中高表达而在K562细胞中无表达。通过以上实验证实所鉴定K562/ADR细胞株为耐药细胞株且耐药性很强。2.千金藤素联合多柔比星促进K562/ADR细胞Drp1去磷酸化和线粒体转位、线粒体分裂和细胞凋亡千金藤素联合多柔比星可以明显降低K562/ADR细胞存活率和增加细胞凋亡,且两药联合作用效果为协同作用。Western Blot结果显示,千金藤素联合多柔比星处理K562/ADR细胞可引起PARP-1的裂解、Caspase 3的激活以及cytochrome c从线粒体释放到细胞质。透射电镜观察发现,千金藤素联合多柔比星组的线粒体发生断裂且有大量自噬体聚集。分子机制研究结果显示,千金藤素联合多柔比星处理K562/ADR细胞可引起线粒体分裂关键蛋白Drp1（Ser637）去磷酸化及Drp1线粒体转位增加。同时我们发现全细胞以及线粒体上自噬标志蛋白LC3也明显增加,提示Drp1线粒体转位可能与自噬体堆积有关。3.千金藤素联合多柔比星导致自噬体过度堆积在其诱导K562/ADR细胞凋亡中发挥重要作用千金藤素联合多柔比星处理K562/ADR细胞可引起全细胞以及线粒体上自噬标志蛋白LC3的表达明显增加。预处理自噬抑制剂3-MA或采用shRNA敲降ATG7可明显阻断千金藤素联合多柔比星所引起的自噬体聚集和细胞凋亡。上述结果表明,过度的自噬体聚集在千金藤素联合多柔比星诱导K562/ADR细胞凋亡中发挥重要作用。4.千金藤素联合多柔比星促进ROS生成流式结果显示,千金藤素联合多柔比星可引起ROS的生成显著增加。预处理超氧阴离子(O2·-)清除剂TBAP可抑制ROS的生成,并可阻断千金藤素联合多柔比星引起的Drp1的去磷酸化和线粒体转位、线粒体分裂和细胞凋亡。结果提示,ROS的生成特别是超氧阴离子(O2·-)在千金藤素联合多柔比星诱导Drp1的去磷酸化和线粒体转位、线粒体分裂和细胞凋亡中发挥重要作用。结论千金藤素协同多柔比星导致自噬体过度堆积,促进ROS生成,诱导Drp1的去磷酸化和线粒体转位、线粒体分裂和细胞凋亡,最终逆转K562/ADR细胞耐药。