骨关节炎（Osteoarthritis,OA）是一种以关节软骨进行性破坏、软骨下骨硬化、滑膜增生、骨赘形成为特征的慢性关节疾病,是世界范围内致残的主要原因。尽管OA的发病率很高,但OA的确切病因和发病机制仍然没有得到很好的了解,目前仍没有理想的OA治疗药物。传统药物可减轻关节部位的疼痛和肿胀,但它们不能修复受损的软骨或恢复组织稳态。软骨是膝关节最重要的结构组成部分,其损伤直接参与OA疾病的发生和进展。与OA发病机制相关的细胞因子,如肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor TNF-α）和白介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）,能够刺激软骨细胞释放软骨降解酶,导致蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白（TypeⅡcollagen,ColⅡ）的消化,使得软骨基质降解,导致炎症性软骨细胞死亡。焦亡,也称为细胞炎性坏死,是一种由gasdermin蛋白介导的程序性细胞坏死,表现为细胞不断膨胀导致细胞膜破裂,导致细胞内容物释放。已有研究表明,细胞焦亡可能在OA发病机制中起重要作用。然而,OA软骨细胞是否发生焦亡、其相关机制如何仍有待阐明。以间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）为代表的细胞疗法近年来被广泛应用于再生医学领域,并在治疗膝关节OA方面取得一定进展。MSCs具有多向分化、多样的可塑性、低免疫原性等生物学特性;可调节局部炎症、细胞凋亡和增殖,参与组织修复,用于治疗OA时可达到一定的延缓退行性改变的作用。与其他成体干细胞相比,人脂肪来源间充质干细胞（human adipose-derived mesenchymal stem cells,hAD-MSCs）来源丰富,易于分离,具有独特的可扩展性。有研究表明MSCs可以抑制细胞焦亡,那么hAD-MSCs是否可以通过抑制软骨细胞焦亡信号来改善OA发展,目前未见报道。本研究观察了OA大鼠模型中hAD-MSCs的治疗作用,并在体内外探讨了hAD-MSCs对软骨细胞焦亡的作用及其机制。目的:明确hAD-MSCs对OA大鼠的治疗作用,阐明hAD-MSCs抑制大鼠软骨细胞焦亡的机制,为hAD-MSCs治疗OA提供实验依据。方法:1.利用Hulth法建立OA大鼠模型,将OA大鼠随机分为模型组、hAD-MSCs（0.5×10~6,1.0×10~6,2.0×10~6cells/只）组和透明质酸阳性药组（HA,10 mg/ml）,另设假手术动物作为对照组,每组10只。所有给药动物于造模六周后关节腔内注射给药一次（50μl/只）,假手术组和模型组动物关节腔内注射等量生理盐水。给药后第六周处死动物,对大鼠手术位膝关节进行X线正侧位检查,行Kellgren–Lawrence（KL）评分;手术显微镜观察大鼠膝关节面结构及软骨损伤情况,行Pelletier评分;HE染色及番红固绿染色检测大鼠膝关节病理情况,行改良后的Mankin评分;ELISA法检测大鼠膝关节滑液中TNF-α和IL-1β的水平;TUNEL法检测软骨组织TUNEL阳性细胞率;免疫组化法检测软骨组织中NLRP3、Caspase1、GSDMD、TNFR1和TNFR2的表达;透射电镜法观测软骨组织焦亡形态学。2.流式细胞术及三系分化实验鉴定hAD-MSCs。两步酶消化法获取大鼠膝关节软骨细胞,以甲苯胺蓝染色和ColⅡ免疫组化染色鉴定。用不同质量浓度TNF-α（5、10、20、40 ng/ml）诱导建立大鼠软骨细胞焦亡模型,CCK-8法检测各组大鼠软骨细胞活力,Western blot检测大鼠软骨细胞焦亡信号相关蛋白,确定最佳刺激浓度,Western blot检测TNF-α刺激后软骨细胞ColⅡ、MMP-13的蛋白表达,扫描电镜观测大鼠软骨细胞焦亡的形态学改变。3.体外共培养体系观察hAD-MSCs对大鼠软骨细胞焦亡的作用。Western blot法检测原代大鼠软骨细胞与不同数量hAD-MSCs共培养后焦亡信号蛋白的表达,确定hAD-MSCs与原代大鼠软骨细胞共培养的最佳比例。利用Transwell法检测hAD-MSCs与原代大鼠软骨细胞共培养后软骨细胞的迁移;CCK-8法检测软骨细胞的活力;Annexin/PI法和TUNEL法检测软骨细胞焦亡。利用免疫荧光法检测软骨细胞中NLRP3、Caspase1和GSDMD的表达;QPCR法检测软骨细胞中NLRP3、Caspase1和GSDMD m RNA水平;Western blot检测软骨细胞NLRP3、Cleaved-caspase1、GSDMD、P-p65、MMP-13、ColⅡ和TNFR1蛋白的表达;ELISA法检测软骨细胞培养上清IL-1β、IL-18的水平;透射电镜观测软骨细胞形态。4.采用小干扰RNA技术沉默原代大鼠软骨细胞TNFR1的表达,Western blot法筛选TNFR1 si RNA转染的最佳序列,检测沉默TNFR1后软骨细胞焦亡信号NLRP3、Cleaved-caspase1、GSDMD的蛋白表达。ELISA法检测hAD-MSCs与软骨细胞共培养体系中的s TNFR1的水平。结果:1.hAD-MSCs对OA大鼠具有治疗作用hAD-MSCs各给药组可不同程度减少关节骨赘形成,改善关节间隙,降低KL评分,降低Pelletier评分,改善大鼠膝关节软骨病理损伤,降低病理评分。ELISA结果显示,与模型组相比,各给药组均可降低大鼠膝关节滑液中TNF-α和IL-1β的水平。2.hAD-MSCs可抑制OA大鼠软骨组织焦亡TUNEL结果显示,OA大鼠软骨组织中TUNEL阳性细胞率明显升高,hAD-MSCs（1.0×10~6 cells/只）治疗后可降低TUNEL阳性细胞率。免疫组化结果显示,模型大鼠软骨组织中NLRP3、Caspase1、GSDMD和TNFR1的表达增加,TNFR2无明显表达,hAD-MSCs治疗可显著降低NLRP3、Caspase1、GSDMD和TNFR1的表达。3.TNF-α（20 ng/ml）体外可诱导大鼠软骨细胞焦亡CCK-8结果显示,与对照组相比,大鼠软骨细胞的活力随着TNF-α浓度升高而逐渐下降;Western blot结果显示,NLRP3、Caspase1、GSDMD、磷酸化核转录因子-κB p65（P-p65）的蛋白表达水平随TNF-α浓度增加逐渐升高;TNF-α（20ng/ml）可诱导大鼠软骨细胞ColⅡ表达下调,基质金属蛋白酶-13（MMP-13）表达上调。扫描电镜结果显示,TNF-α（20 ng/ml）可使关节软骨细胞肿胀破裂,显微结构发生明显破坏。4.hAD-MSCs体外可抑制TNF-α诱导的软骨细胞焦亡在体外,hAD-MSCs与原代大鼠软骨细胞以1∶1比例共培养后,hAD-MSCs可显著抑制TNF-α诱导的软骨细胞焦亡信号蛋白水平;促进软骨细胞的迁移;增强软骨细胞的活力;降低Annexin/PI的双阳细胞数和TUNEL阳性细胞率,提示hAD-MSCs可抑制软骨细胞焦亡。进一步研究显示,hAD-MSCs可降低软骨细胞中NLRP3、Caspase1和GSDMD的荧光表达水平和m RNA表达水平,下调软骨细胞NLRP3、Cleaved-caspase1、GSDMD、P-p65、MMP-13和TNFR1的蛋白表达水平,上调ColⅡ的表达;hAD-MSCs还可降低软骨细胞培养上清IL-1β、IL-18的水平。透射电镜结果显示,hAD-MSCs可恢复软骨细胞被破坏的结构,恢复细胞器功能。5.hAD-MSCs通过分泌s TNFR1抑制TNF-α诱导的软骨细胞焦亡利用小干扰RNA技术沉默原代大鼠软骨细胞TNFR1的表达,Western blot结果显示,软骨细胞中NLRP3、Cleaved-caspase1、GSDMD的蛋白表达显著降低,并与hAD-MSCs共培养后的效果相当,提示hAD-MSCs抑制软骨细胞焦亡可能与抑制TNFR1表达相关。ELISA法进一步检测hAD-MSCs与软骨细胞共培养体系中的s TNFR1水平,结果显示,对照组与TNF-α刺激组均未产生s TNFR1,而hAD-MSCs与软骨细胞共培养体系中的s TNFR1水平较高,提示hAD-MSCs分泌高水平的s TNFR1,竞争性阻断TNF-α诱导的软骨细胞焦亡,可能是hAD-MSCs抑制软骨细胞焦亡的分子机制。结论1.hAD-MSCs关节腔给药可以改善OA大鼠膝关节软骨损伤,降低关节病理评分,降低关节滑液炎性因子水平,具有明显的治疗作用。2.OA大鼠膝关节软骨组织TUNEL阳性细胞率升高,且NLRP3、Caspase1、GSDMD等焦亡信号蛋白水平明显升高,提示软骨细胞焦亡参与了OA病理进程。hAD-MSCs关节腔给药可以降低TUNEL阳性细胞率,下调软骨组织中NLRP3,Caspase1,GSDMD和TNFR1的表达,改善软骨细胞的焦亡形态学变化,提示hAD-MSCs可抑制OA软骨细胞焦亡。3.hAD-MSCs体外可促进软骨细胞迁移,增强细胞活力,抑制细胞焦亡信号蛋白的荧光表达与基因表达,抑制炎症因子的水平,保护细胞外基质。4.hAD-MSCs体外可抑制TNF-α诱导的软骨细胞焦亡信号蛋白的表达,其机制可能与分泌s TNFR1阻碍了TNF-α与TNFR1的结合相关。