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帕金森病(Parkinsons disease，PD)又称帕金森综合症，是一种仅次于阿尔兹海默症(Alzheimer disease，AD)的第二大进行性中枢神经系统退行性疾病，主要表现为静止时颤抖、僵直、动作迟缓、平衡感差等。它的发病人群主要集中于中老年人群，尤其是60岁以上的老人。它的病因目前不明，据推测其发病机制和遗传因素、环境因素以及自身年龄因素相互作用有关。遗传因素主要是指各种疾病相关基因的突变，比如PARK2、PINK1、J-1、LRRK2基因等。PINK1和PARK2基因皆为PD相关致病基因，与常染色体隐形遗传早发性PD综合症密切相关，其中单个基因的突变即可诱发早发性PD综合症，然而单个基因突变所诱发的PD症状并不明显，因此我们设想如果同时突变这两个基因是否能加快PD症状的产生或是表现出更好的PD症状。 现阶段的帕金森动物模型主要为果蝇、斑马鱼、小鼠和大鼠等小动物模型，无法真实地反应人类帕金森症状。因此我们预备建立一种大动物模型——帕金森模型猪，以便更加真实地模拟人类帕金森病症。与小鼠相比，猪在进化上与人类更为接近，猪的神经系统、消化系统、皮肤、营养需要、骨骼发育以及矿物质代谢等都与人类极其相似;相比于大、小鼠的无脑沟和脑回，猪的大脑结构有脑沟和脑回，且容量等与人类大脑非常相似;而且其基因表达模式，病理发生过程更接近于人类。通过对多种神经退行性疾病猪模型的研究发现，猪能模拟出多种小鼠模型无法模拟的疾病表型。因此，猪可以作为一种理想的帕金森综合症动物模型。 我们针对猪的PARK2和PINK1基因的外显子分别设计了gRNA，将其和Cas9载体共转染巴马小型猪的胎儿成纤维细胞后，获得了纯合的PARK-/-/INK1-/-双基因敲除的细胞系，其双基因的双敲概率高达38.1％。选择状态较好的几株细胞系混合后作为核供体，进行体细胞核移植和胚胎移植。我们总共移植了1729个重组胚胎，分别植入10头代孕母猪，其中有四头怀孕到期并自然分娩，总共产下20头克隆仔猪。经测序鉴定，20头仔猪全部为阳性，即PARK2-/-/P INK1-/-双基因敲除克隆猪。在用PINK1和Parkin抗体进行免疫荧光染色后可发现:WT仔猪大脑中可观察到染色明显的PINK1和Parkin蛋白，而PARK2-/-/PINK1-/-双基因敲除克隆仔猪的大脑组织中检测不到PINK1和Parkin蛋白的表达，表明PINK1和PARK2基因的敲除确实导致其编码蛋白的缺失。历经一年半的培育，我们现已获得了F1代18头，其中10头母猪，8头公猪，皆为PARK2和PINK1基因单敲，即杂合子，表明PARK2-/-/PINK1-/-双基因敲除克隆猪的突变是可以生殖系遗传的。 本次研究获得的PARK2-/-/PINK1-/-双基因敲除克隆猪可作为帕金森症大动物模型，用于研究其发生机制和评估相关治疗药物的有效性和安全性;并且本次研究将新兴的CRISPR/Cas9技术与体细胞克隆相结合，不仅使猪基因打靶效率更高、更为精确，而且在一个世代内首次实现了大动物双基因的等位敲除。该技术路线的建立将大大加速多基因修饰猪制备，对农业而言，可促进猪的生产性能的改良;对于生物医药领域，也可加速大动物疾病模型的建立。