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第一部分PFTα诱导MC3T3-E1细胞成骨分化的机制研究目的探索PFTα诱导成骨分化的作用机制方法本研究采用CCK-8检测PFTα对MC3T3-E1细胞毒性,筛选PFTα诱导MC3T3-E1细胞成骨分化的最佳浓度。细胞经PFTα处理后,real-time PCR、westernblot、免疫荧光法检测细胞内NOX4水平,流式细胞仪检测ROS水平。制备并筛选siNOX4i并将siNOX4转染细胞,观察干扰NOX4后PFTα对MC3T3-E1细胞成骨诱导的作用机制。分别予细胞ALP、茜素红染色观察成骨情况;qPCR,WB、IF检测Nox4;流式检测ROS的表达。结果PFTα能显著提高MC3T3-E1细胞成骨分化。在10-80μmol范围内随着PFTα浓度增高细胞活力下降。同时,随着PFTα浓度增加,NOX4和ROS水平也逐步增加,成骨能力提升。在转染si-NOX4的细胞后,PFTα增加NOX4-ROS的作用和促进成骨的作用明显受到抑制。结论PFTα通过PFTα-NOX4-ROS通路促进MC3T3-E1细胞成骨分化第二部分SIS-ECM/PLGA/PFTα,复合膜体外诱导MC3T3-E1细胞成骨的研究目的小肠黏膜下层细胞外基质(SIS-ECM)复合材料在组织工程中备受关注,但在骨修复中的研究却很少。本研究采用静电纺丝技术,将脱细胞胶原膜(SIS-ECM)与聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)纳米纤维组装成独特的双层复合膜。方法为了增强复合膜的生物活性,在PLGA静电纺丝液中预载了 p53抑制剂pifithrin-α(PFTα)。我们用电镜观察SIS-ECM/PLGA结构,并将复合膜与MC3T3-E1细胞培养,观察细胞粘附性、毒性(CCK-8、溶血试验),然后在体外培养、成骨诱导,观察MC3T3-E1细胞成骨分化及矿化的情况。结果所制备的SIS-ECM/PLGA/PFTα复合膜具有多孔隙、高孔隙相通率。SIS-ECM/PLGA具有良好的细胞粘附性,且能促进MC3T3-E1细胞增殖分化。CCK8试验结果提示所有复合膜的细胞毒性为I级;溶血试验显示相比于阳性对照组,复合膜不会造成溶血,具有良好的组织相容性。SIS-ECM/PLGA/PFTα+MC3T3-E1细胞体外培养并用成骨诱导剂培养后,结果显示SIS-ECM/PLGA/PFTα复合膜能促进MC3T3-E1的成骨分化和矿化。结论双层SIS-ECM/PLGA复合膜载荷PFTα促进了血管化骨的再生,组织相容性好。第三部分SIS-ECM/PLGA/PFTα复合膜体内诱导成骨的研究目的探索SIS-ECM/PLGA/PFTα在动物体内诱导成骨的能力方法试验分成四组:Ⅰ组为SIS-ECM组(对照组),Ⅱ组为SIS-ECM/PLGA组,Ⅲ组为 SIS-ECM/PLGA/PFTa20 组,Ⅳ组为 SIS-ECM/PLGA/PFTa40 组。各组对应的材料与MC3T3-E1细胞—起培养。将24只大鼠随机分成4组,每组每只大鼠的左腿制作股四头肌肌袋,并将四组对应的膜植入左侧大腿肌袋。术后30天后处死大鼠,取植入物周围组织行苏木精-伊红染色染色、马松染色,同时对大鼠的心肝脾肺肾等脏器行切片染色以评估材料的毒性。结果相较于对照组,复合膜能显著提高成骨能力,增加骨矿化及血管长入。所有动物脏器切片染色均未见明显损伤改变。结论SIS-ECM/PLGA/PFTα能诱导成骨、矿化,促进血管长入,生物相容性好,较安全。