背景：克隆演变学说是最早用于解释实体肿瘤起始和进展生物学且被大部分学者接受的学说,它主要以遗传变异的多样性为理论依据,认为所有的肿瘤细胞都具有生成新的肿瘤的潜能。随着对肿瘤研究的不断深入,科学家提出了肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSCs)学说,认为肿瘤干细胞是肿瘤中极小部分具有自我更新、无限增殖及分化潜能的细胞,肿瘤之所以具有无限增殖能力,其根本在于肿瘤细胞中存在占极少数量的肿瘤干细胞。目前已从人白血病、乳腺癌、胶质瘤、肺癌、结直肠癌、前列腺癌,黑色素瘤及胰腺癌等14种常见肿瘤中分离、鉴定出CSCs。尽管目前大多数研究结果支持肿瘤起源于某类具有“干性”特征的肿瘤细胞,然而学术界对肿瘤干细胞学说还存在很大的争议。Shipitsin等通过分析基因表达谱发现尽管乳腺癌干细胞和普通乳腺癌细胞分别是更原始和更分化的细胞群体,且它们的基因表达差异可能存在预后相关性,但是这些细胞之间的遗传学差异支持克隆进化学说参与了肿瘤内的异质性。而Kelly等通过将小鼠来源的淋巴瘤和白血病细胞移植致组织兼容的小鼠中得出所有肿瘤细胞均具有高致瘤的结果,认为肿瘤的生长在于肿瘤细胞与其周围微环境的适应能力而不在于细胞是否具有干细胞特征。这些争议牵涉到传统的克隆演变学说,直接冲击了肿瘤干细胞假说的基础一致瘤性。这一系列的争议给肿瘤干细胞的进一步研究及对这一学说的应用前景提出新的挑战,然而,这些争议着实推动了肿瘤研究的进展。另一方面,Morel等发现通过EMT过程能将人永生化的人正常乳腺上皮细胞(HMLEs)诱导成乳腺癌干细胞。这些研究结果为EMT在肿瘤细胞的播散及持续生长中的作用提供了充分的证据,更重要的是,它们建立了EMT与肿瘤干细胞起源之间的联系。总之,肿瘤干细胞研究至今,仍存在不少争议；争议的关键在于其是否具有特有的致瘤性,而分化的肿瘤细胞却不再具有成瘤能力。其实,解决这一争议的方法在于证实单个肿瘤细胞能否最终发展成肿瘤。然而,因为技术上的原因,目前仍很难准确的将单个肿瘤细胞接种于体内模型进行研究。另一方面,如果这一学说是错误的,那么之前的研究为什么会得出支持肿瘤干细胞存在的证据?科学家是否忽视了产生这些证据背后的本质呢?此外,为什么会导致EMT具有产生肿瘤干细胞的能力?寻找这些问题的答案可能需要对肿瘤干细胞的致瘤性及EMT在介导肿瘤干细胞恶性生物学行为中的本质进行探讨。目的1)通过单细胞克隆扩增-成瘤法探讨不同乳腺癌细胞株中致瘤性细胞所占的比例。2)探讨EMT与悬浮培养富集乳腺癌干细胞的关系。3)探讨EMT在肿瘤干细胞特殊生物学行为中的作用。4)分析导致肿瘤干细胞具有高致瘤性的潜在的机制。5)乳腺癌临床样本中分析肿瘤干细胞表型与间充质表型的一致性。材料与方法1) CD44+/CD24-/low细胞的流式检测及分选：将需检测的细胞,制成单细胞悬液,以PBS调整细胞密度为每管1×106/100μl。设实验组和同型对照组。实验组加入CD44-FITC和CD24-PE标记的单克隆抗体,对照组加入相应的同型对照抗体,4℃避光温育,30min后加5mlPBS漂洗去除未结合的抗体,1小时内用流式细胞仪检测或者分选。2)单细胞克隆扩增-成瘤法：将达到80%融合状态的贴壁培养细胞,经胰酶消化成单细胞状态,按有限稀释法,将细胞稀释成10cells/ml,混匀后将细胞悬液接种于96孔板,200μl/孔,之后在倒置光学显微镜下观察仅含1个细胞的孔并标记,接种完后将细胞置于培养箱中培养。待单个细胞长成适当大小的细胞集落后,按上述消化方法将孔里的细胞集落消化并将细胞悬液相应地接种于24孔板继续培养。待细胞生长至适当融合状态后,按上述方法将细胞转移至6孔板培养；相似地,细胞最后扩大培养于1Ocm×10cm培养皿或者T75培养瓶中。收集由单个细胞扩增出来的细胞,制成单细胞悬液并计数,用5ml PBS洗涤两次以去除残留血清,再将细胞重悬于含1:matrigel的无血清的培养基中,最后细胞以1×107cells/200μl的体积皮下接种于4周龄雌性免疫缺陷BALB/c裸鼠体内；对于雌激素受体阳性的细胞(包括T47D,MCF-7和BT474),受体小鼠同时在大腿肌注0.05mg17-β雌二醇,每周注射一次。每周两次触摸观察肿瘤生长情况。3)3D培养技术检测单个肿瘤细胞的体外成瘤能力：水泥胶包埋96孔板的每小孔,利用有限稀释法将细胞制成10cells/ml,与含胶的培养液等比例混匀,100gl/孔接种于水凝胶包埋的孔里,显微镜下观察只含单个细胞的孔并标记；在37℃、5%CO2培养箱中静止培养。4)乳腺癌微球体的培养：将需要进行悬浮球培养的细胞重悬于不含血清的DMEM/F12培养基,并添加20ng/ml EGF、20ng/ml bFGF、0.4%BSA和2%B27,以50,000cells/ml接种于六孔板(3ml/孔),在37℃、5%CO2培养箱中静止培养,每隔一天加1ml新鲜培养基。5)EMT诱导因子共培养乳腺癌细胞：流式细胞术分选出非肿瘤干细胞亚群重悬于分别添加有50ng/ml IL-6,20ng/ml EGF和20ng/ml b-FGF、或者10ng/mlTGF-β1的相应培养基中,置于37℃,5%CO2培养箱培养。6)MTT细胞增殖检测及阿霉素药物敏感性检测：细胞增殖检测：消化收集细胞,重悬于相应的培养基并计数,用有限稀释法将细胞悬液稀释成5×103cells/ml,吹打均匀后接种于96孔板,200μl/孔,置于37℃,5%CO2培养箱培养。在相应的96孔板上设调零孔,即加200μl/孔不含细胞的相应培养基。分别在培养12h、36h、60h、84h、108h及132h后每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4h。终止培养,小心吸去孔内培养液。每孔加入150u1二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。阿霉素药物敏感性检测：消化收集细胞,重悬于相应的培养基并计数,用有限稀释法将细胞悬液稀释成5×104cells/ml,吹打均匀后接种于96孔板,200μ1/孔,置于37℃,5%CO2培养箱培养。在相应的96孔板上设调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)及对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜),培养12h待细胞贴壁后,检测孔每孔加10μ1阿霉素工作液至终浓度为10μg/ml,继续培养。分别在加药后4h、24h、48h、72h、96h及120h后每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4h,同上述方法检测吸光值。7)细胞照射：采用Varian2100C直线加速器6MV X线为放射源,源皮距照射,剂量率400cGy/min, SSD=100cm, PDD=80%,照射野100mm×100mm,按0,2,4,6,8Gy的剂量分别给予照射。8)克隆形成实验及放射生物学参数及剂量存活曲线的拟合：将照射后的细胞置于37℃,5%C02的孵育箱进行培养,连续培养15-25天。终止培养后常规以PBS缓冲液洗涤细胞2次,去除培养液中的蛋白成分,每孔加入1.5m1100%甲醇,室温固定15分钟；PBS清洗两次,每孔加入1ml1%的结晶紫染色后,室温作用20分钟；流水缓慢洗去多余染液,晾干,在显微镜下计算细胞>50个的细胞克隆数,计算克隆形成率(克隆形成率=生成的克隆数/接种细胞数×100%)和存活分数(survival fraction, SF=受照射细胞的克隆形成率/对照组细胞克隆形成率×100%)。最后,对所得的存活分数的平均数进行分析,运用GraphPad Prism5.0软件进行单击多靶模型曲线拟合,并根据单击多靶模型求出D0、Dq及N,其中logN=Dq/DO。9)细胞迁移能力检测：收集细胞,用5ml PBS洗涤3次,充分去除残留的血清,离心后将细胞重悬于含0.1%BSA的培养基(不含血清及细胞因子)中并计数,调整细胞密度为5×105cells/ml,吹打混匀后吸200μ1细胞悬液接种于transwell上室,并在下室加入500μ1完全培养基,置于37℃、5%C02的培养箱中培养。培养24小时后取出小室置于24孔板,加适量的PBS泡洗5次,然后用0.4%多聚甲醛固定20分钟,再用PBS泡洗2次,其后加适量的1%的结晶紫染色20分钟,最后用PBS洗涤去除未染的结晶紫并用棉签轻轻擦去上层未穿透的细胞,光学显微镜下观察并拍照,选择随机的5个视野计算小室底面的细胞。10)制备慢病毒载体稳定过表达：niR-200c:以人基因组DNA为模板PCR扩增目的基因；表达载体酶切后回收线性化的载体片段；目的基因片段与线性化的载体片段经同源重组后转化E.coli感受态细胞；用菌落PCR鉴定转化子,阳性克隆送测序；测序无误的克隆进行质粒抽提；采用脂质体法将慢病毒包装系统中3种质粒按比例共转染293细胞,收集上清液,离心过滤后,得到慢病毒悬液。病毒滴度采用qPCR实验进行测定。将慢病毒和空病毒载体感染乳腺癌细胞。采用流式细胞仪分选出GFP(+)细胞进行扩大培养。Real time qPCR检测miR-200c表达水平。11) Real time RT-PCR检测基因的表达水平：收集细胞,提取RNA,逆转录成cDNA,基于ABI Prism7500系列检测系统,使用ToYoBo公司的SYBR Green试剂盒进行实时荧光定量PCR。12) Western blotting检测细胞中E-cadherin, Vimentin, CD44及CD24蛋白的表达。13)细胞免疫荧光技术检测细胞中E-cadherin, Vimentin, CD44及CD24蛋白的表达。14)免疫组化检测组织样本中E-cadherin, Vimentin, Fibronectin, CD44及CD24分子的表达。15)统计方法：实验结果应用SPSS13.0软件,以两个或多个独立样本率比较的x2检验、单向方差分析(One-Way ANOVA)及Bonferroni多重比较方法进行统计分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果1)致瘤性细胞普遍地存在于乳腺癌细胞株中不管是CSCs群体还是non-CSCs群体,均呈现出高比例的克隆性细胞,形成的细胞克隆可以经不断扩大培养获得大量的肿瘤细胞。当达到1×107数量级时,将细胞重悬于含1:1Matrigel的无血清培养基并接种于免疫缺陷的BALB/c裸鼠体内。经这种克隆扩增法获得的细胞,不管它们来源于CSCs群体还是non-CSCs群体,均能在裸鼠体内形成肉眼可见的肿瘤。而对于永生化的正常人乳腺上皮细胞仅含少量的克隆性细胞,而且这些细胞扩增出来的细胞群体不能在免疫缺陷的小鼠体内形成任何肿瘤。2)悬浮培养富集肿瘤干细胞与细胞的上皮-间充质转化有关分选出来的非乳腺癌干细胞经悬浮培养后同样能富集具有干细胞标记的细胞群体；悬浮培养获得的细胞具有EMT相关的基因表达模式；在高粘附培养板或者添加血清后细胞贴壁生长,细胞形态呈现间充质样外观；细胞免疫荧光及Western blot检测显示上皮标记E-cadherin表达下调,而间充质标记Vimentin的表达上调。3)“肿瘤干细胞”是一群具有间充质表型的细胞亚群分选出来的非肿瘤干细胞在含有不同的EMT诱导因子的培养基中培养48小时后出现细胞形态由鹅卵石样向梭形或者星形样转变,这种现象在luminal型乳腺癌细胞中尤为明显。诱导培养10天后,在luminal型细胞中显著富集了CD44+细胞(在MCF7细胞中还显著富集了CD44+/CD24-/low细胞),在Basal型细胞株中显著富集了CD24-细胞,在CD44+的MCF-10A细胞中同样显著富集了CD24-细胞,这些细胞诱导产生CD44+或者CD24-细胞的结果与悬浮培养产生具有这些表型的细胞的结果一致。进一步检测发现这些诱导产生的CD44+或者CD24-细胞呈现出与EMT相关的基因表达模式及蛋白表达模式。4)EMT并不赋予肿瘤细胞致瘤性而只是赋予肿瘤细胞其它恶性特征利用克隆扩增-成瘤法检测了经不同细胞因子诱导后产生的CD44+或者CD24-细胞的致瘤潜能。发现经EMT诱导后产生的这些细胞并没有表现出更高的克隆及成瘤能力。进一步检测这些细胞的其它生物学功能,发现经IL6和EGF+bFGF诱导产生的CD44+或CD24-细胞均具有显著增高的细胞增殖能力、阿霉素抵抗、辐射抵抗及侵袭能力。5)细胞增殖能力的差异可能是导致CSCs的发现的主要原因当用含生长因子(40ng/mIEGF和40ng/mlbFGF)的基质胶重悬non-CSCs后接种于NOD/SCID小鼠体内时,non-CSCs能在相同的时间内形成更多的肿瘤,形成的肿瘤数甚至多于CSCs在相同时间里所形成的肿瘤数。6)肿瘤细胞致瘤性并不依赖于间充质特性间充质型乳腺癌细胞株稳定表达miR-200c后,细胞形态发生明显的MET样改变,即从梭形的间充质形态向鹅卵石样上皮形态转化。定量RT-PCR结果显示基因呈现MET相关表达模式,即上皮表型相关基因E-cadherin表达上调,而间充质表型相关的基因(Vimentin、N-cadherin和Fibronectin)表达下调；干细胞相关的标记CD44基因表达也明显下调。流式检测显示稳定表达miR-200c组细胞具有干细胞标记的细胞比例显著减少,而非干细胞比例显著升高。Westernblot同样证实了上皮标记的上调,间充质标记的表达的抑制,同时伴随明显的CD44表达抑制。发生MET后明显减慢了细胞的生长速度,增加了细胞对阿霉素的药物敏感性及对辐射的敏感性,同时细胞的侵袭能力明显受抑制。然而MET后并没有影响克隆性及致瘤性细胞的比例。7)乳腺癌临床样本中干细胞表型与间充质表型高度一致肿瘤干细胞阳性的样本中上皮型标记E-cadherin表达的阳性率为34.4%(11/32),而在非肿瘤干细胞样本组中E-cadherin表达的阳性率为75.0%(39/52),两组样本中E-cadherin表达的阳性率有显著统计学差异(x2=13.570,P=0.000)；另一方面,间充质标记Vimentin表达在肿瘤干细胞组的阳性率为71.9%(23/32);而其在非肿瘤干细胞组的表达阳性率仅为21.2%(11/52),两组中Vimentin的表达的阳性率同样有显著的统计学差异(x2=21.153,P=0.000)。我们还进一步研究了典型的间充质表型E-cadherin-/Vimentin+(甚至E-cadherin-/Vimentin+/Fibronectin+)在两组样本中的比例,发现这些表型在两组样本中的比例存在显著的统计学差异(E-cadherin-/Vimentin+:x2=17.376, P=0.000; E-cadherin-/Vimentin+/Fibronectin+:x2=14.114, P=0.000)。因此,在临床肿瘤样本中证实表达乳腺癌干细胞标记的样本同时表达间充质标记,从而支持了我们关于肿瘤干细胞是一群具有间充质样特性的细胞群体的结果。结论1.致瘤性细胞普遍地存在于乳腺癌细胞中；2.悬浮培养富集肿瘤干细胞与细胞经历EMT有关；3.肿瘤干细胞是一群具有间充质表型的细胞亚群；EMT并不赋予肿瘤细胞致瘤性而只是赋予肿瘤细胞其它恶性特征,即肿瘤细胞的致瘤性并不依赖于间充质特性；细胞增殖能力的差异可能是导致肿瘤干细胞被发现的主要原因；4.乳腺癌临床样本中干细胞表型与间充质样表型一致。