[目 的]肝细胞癌占肝癌的绝大多数,是最常见的肝癌。与其他器官相比,肝脏拥有其独特的微环境,加上缺乏生物标记物来识别晚期或早期转移的肿瘤以及识别耐药的发生,加上肿瘤内的高度异质性,使得肝癌治疗难上加难。自然杀伤细胞是一种理想的肿瘤免疫治疗工具。提高NK细胞抗肿瘤的能力是治疗肿瘤的理想方案之一。肿瘤微环境能够对NK细胞的分化、激活和功能发挥产生负面影响。这种影响可能通过调节NK细胞的代谢来实现。醛酮还原酶AKR1B10在肿瘤组织中高表达,且醛糖还原酶抑制剂Fidarestat可以直接抑制AKR1B10的表达,并且Fidarestat已经被证明对某些肿瘤有效,且药效安全无副作用。基于此,我们推测肿瘤侵润的NK细胞在肿瘤微环境作用下,NK细胞中AKR1B10的表达升高,NK细胞的糖酵解和乳酸代谢发生变化,从而影响了 NK细胞的抗HCC活性。Fidarestat是否有抗HCC作用,对HCC的抑制作用是否通过对NK细胞的代谢调节来增强机体自身对HCC的杀伤,这一系列功能是否通过Fidarestat对NK细胞中的AKR1B10的调节来实现,这些调控机制尚不清楚。因此,本文对Fidarestat的抗HCC功能进行检测,并试图阐明Fidarestat治疗肝癌的可能分子机制,为癌症治疗提供理论基础。[方 法]为了研究Fidarestat对HCC的抗肿瘤作用,我们建立了裸鼠移植瘤模型。在确认Fidarestat对不同肝癌细胞系的有效浓度后,通过给予有效浓度的Fidarestat,检测用药后裸鼠的体重,以明确药物在体内的毒性,检测裸鼠成瘤的大小及重量,以及肺组织中的转移情况,明确药物在裸鼠移植肝癌模型中的抗HCC能力;使用流式细胞术的方法对瘤体内的免疫细胞的数量及比例进行分析,再次流式分析NK细胞中GranzymeB、Perforin、IFN-γ及TNF-α的阳性细胞比例,检测其杀伤活性变化,通过免疫组化进一步确认肿瘤浸润性NK细胞的数量,ELISA方法检测血清中细胞因子IL-2,IFN-γ,TNF-α水平变化,以此确定Fidarestat对免疫细胞的影响;进一步使用NK细胞特异性抗体模拟NK细胞耗竭,检测裸鼠成瘤的大小及重量,以及肺组织中的转移情况,确定Fidarestat确实是通过对NK细胞的调节来抗肿瘤活性;体外NK细胞与肝癌细胞共培养并用Fidarestat进行干预,通过CCK-8、Transwell和划痕实验,检测肝癌细胞的存活率、侵袭和迁移能力,明确Fidarestat-NK细胞在体外对肝癌细胞的生存、特性的影响;通过对NK细胞糖酵解能力的检测以及AKR1B10的表达水平检测,确定Fidarestat能够影响NK细胞代谢功能以及AKR1B10的表达;通过对NK细胞中AKR1B10进行过表达干预,再次检测用药/非用药时过表达AKR1B10的NK细胞的糖酵解能力、乳酸产生水平,同时检测NK细胞对Huh7细胞的杀伤,以及NK细胞和肝癌细胞共培养时候肝癌细胞的存活率、侵袭和迁移能力,确定Fidarestat通过抑制NK细胞中AKR1B10的表达,提高NK细胞的糖酵解能力来发挥抗肿瘤作用。最后,通过相关通路蛋白的表达检测,以确定药物通过上调PI3K/AKT/mTOR和MAPK轴分子的表达,抑制TGF-β分子的表达,以明确Fidarestat的抗HCC能力及机制。[结 果]我们首先在不同肝癌细胞系中确定Huh7是对Fidarestat最敏感的肝癌细胞系,10μM的Fidarestat是最低有效浓度（IC50约为7-8μM）。然后在裸鼠成瘤模型中,发现Fidarestat在体内有着良好的抗肿瘤活性,并呈现剂量依赖性;同时,荷瘤裸鼠体重无明显抑制,也无相关用药死亡,表明Fidarestat直接毒性较弱。对荷瘤裸鼠的肺部切片进行H&E观察,发现给予Fidarestat后,可以显著抑制荷瘤裸鼠的肺转移。提示Fidarestat在体内有着良好的抗肿瘤活性。随后对荷瘤裸鼠免疫细胞进行分析,推测Fidarestat的抗肿瘤活性可能与其对NK细胞的作用相关。发现在Huh7移植瘤模型中,Fidarestat作用后,裸鼠肿瘤组织中NK细胞的数量出现显著上调,对NK细胞进行染色,进一步发现Fidarestat作用的肿瘤组织中,NK细胞比例显著上调,提示着Fidarestat可以招募NK细胞至肿瘤组织中,推测其通过影响NK细胞来发挥抗肿瘤活性。接着,分离了原代NK细胞,对NK细胞杀伤和活化相关分子作以检测。通过流式细胞检测,发现Fidarestat可以上调颗粒酶B、穿孔素、IFN-γ及TNF-α阴性的NK细胞比例,表明Fidarestat可能通过提升NK细胞杀伤性细胞因子发挥其抗肿瘤活性。随后检测了血清中IL-2、IFN-γ及TNF-α水平,发现Fidarestat可以显著提升这几种细胞因子水平。说明Fidarestat可能通过增加NK细胞脱颗粒能力及分泌炎症细胞因子发挥其抗肿瘤活性。接下来,本研究选择使用不同效靶比的细胞将NK细胞与正常肝细胞/肝癌细胞系进行共培养。发现随着不同效靶比中NK细胞比例增加,可以增强Fidarestat作用后的NK细胞对肝癌细胞的杀伤活性,表明Fidarestat可以影响NK细胞功能增强其杀伤活性;而同时Fidarestat并不会增加NK细胞对正常肝细胞系HL-7702的杀伤活性。细胞侵袭实验发现,Fidarestat作用后的NK细胞可以抑制肝癌细胞Huh7细胞的侵袭;划痕实验也证明Fidarestat作用后的NK细胞可以抑制肝癌细胞MHCC97L及Huh7细胞的迁移。因此,Fidarestat可以在体外通过作用于NK细胞,抑制肝癌细胞的活性,同时抑制肝癌细胞的侵袭与迁移。为了更进一步确证Fidarestat是否通过影响NK细胞活性,提高Fidarestat抗肿瘤活性,本研究选择在体内对NK细胞进行耗竭。体内移植瘤实验显示,Fidarestat作用后可以增加肿瘤中NK细胞浸润,而体内注射NK细胞耗竭剂Anti-NK1.1后可以明显抑制NK细胞向肿瘤组织的募集。同时,与前期实验一致的是,Fidarestat可以抑制肿瘤细胞的增殖,表现为肿瘤体积及重量的减小,同时可以抑制肿瘤细胞向肺部的转移。与预期一致的是,给予NK细胞耗竭剂后,可以显著削弱Fidarestat的药效,表现为Fidarestat对肿瘤的抑制活性减弱,同时肿瘤细胞向肺部转移增加。因此,Fidarestat可以在体内及体外,通过影响NK细胞功能,抑制肝癌转移、侵袭及肝癌细胞活性;而对正常肝细胞杀伤较小。在Huh7荷瘤裸鼠模型中,给予Fidarestat处理后,分离原代NK细胞对NK细胞的糖酵解能力进行检测,Fidarestat处理过的NK细胞的糖酵解能力上调,同时促进其乳酸产生;而通过Western Blot进行检测,发现Fidarestat可以下调NK细胞中AKR1B10的表达。通过体外实验检测NK92细胞中AKR1B10蛋白表达情况,发现Fidarestat可以下调NK92细胞AKR1B10的表达,与原代NK细胞相一致。构建过表达AKR1B10的质粒并包装为慢病毒进行转导,在NK细胞中过表达AKR1B10。Western blot检测发现,慢病毒转导AKR1B10后,NK92细胞中AKR1B10的表达明显上调;Fidarestat单独作用可以抑制AKR1B10表达,而过表达AKR1B10可以削弱Fidarestat对AKR1B10的抑制作用;加入Fidarestat,发现Fidarestat可以促进NK细胞糖酵解,促进乳酸产生;空载质粒组对糖酵解及乳酸影响不大,而在过表达AKR1B10基础上加入Fidarestat后,Fidarestat对NK细胞糖酵解及乳酸产生能力的促进作用减弱,表明Fidarestat通过抑制AKR1B10从而促进糖酵解。在过表达AKR1B10的基础上,将NK细胞与Huh7细胞进行共培养,发现过表达AKR1B10的NK细胞再加入Fidarestat后,NK92细胞对Huh7细胞的杀伤活性减弱;而通过划痕实验和侵袭实验,发现过表达AKR1B10后,再加入Fidarestat,Fidarestat通过NK细胞对Huh7细胞侵袭和迁移的抑制能力减弱。最后,使用Western blot检测Fidarestat体外作用NK细胞后,检测相关通路变化的情况,发现Fidarestat可以激活PI3K/AKT/mTOR和MAPK轴分子的表达,以及抑制TGF-β分子的表达。说明Fidarestat可能干预了 PI3K/AKT/mTOR和MAPK分子轴来影响NK细胞的糖酵解、乳酸生成和细胞生长分化,同时可能通过抑制TGF-β通路来影响NK细胞代谢和功能。[结 论]Fidarestat通过下调NK细胞中AKR1B10,促进NK细胞糖酵解,增强NK细胞杀伤肿瘤细胞的能力。在体内可以抑制荷瘤裸鼠肿瘤的生长及向肺部转移,体外也可以增加NK细胞对肝癌细胞的杀伤活性,同时抑制肝癌细胞的迁移和侵袭能力。同时Fidarestat可以激活PI3K/AKT/mTOR和MAPK轴分子的表达,以及抑制TGF-β分子的表达。总的来说,Fidarestat可以通过下调AKR1B10改善NK细胞糖代谢失调功能紊乱发挥抗肝癌作用。