目的:探讨体外过表达或下调内皮祖细胞G蛋白亚单位Gα13表达水平后对内皮祖细胞增殖、迁移等生物学功能的影响;探讨过表达或下调Gα13在内皮祖细胞中表达水平后,可通过RhoA/ROCK1信号通路来调控内皮祖细胞的增殖、迁移等生物学功能。方法:1.获取成人外周血50ml,通过密度梯度离心法获取人外周血来源的单个核细胞(peripheral blood monoclonal cells,PBMCs),然后借助差速贴壁法和内皮祖细胞专用培养基定向诱导培养内皮祖细胞,待细胞贴壁后继续培养14~28天,光学显微镜下观察内皮祖细胞的细胞形态变化,应用流式细胞仪检测细胞特征性表面标志的表达情况,并使用乙酰低密度脂蛋白检测细胞吞噬能力,加入荆豆凝集素检测细胞结合能力,加入血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)抗体检测细胞vWF表达情况,从而鉴定所得细胞为内皮祖细胞;2.运用Gα13质粒过表达或Gα13 siRNA下调内皮祖细胞中Gα13的表达后,检测其Gα13表达含量变化,并运用transwell实验、wound healing实验以及CCK法分别检测内皮祖细胞迁移、增殖能力改变;3.获得过表达或下调Gα13表达后的内皮祖细胞,运用Western blot检测内皮祖细胞中RhoA、ROCK1、MLC等蛋白的表达水平,从而验证Gα13通过RhoA/ROCK1信号通路调控内皮祖细胞生物学功能。结果:1.通过密度梯度离心法获得人外周血来源单个核细胞后,经差速贴壁法和内皮祖细胞专用培养基定向诱导培养,使用相应的内皮祖细胞特异性表面标志物,包括CD31、CD133、vWF、VEGFR-2,检测内皮祖细胞CD31阳性率96.33%,CD133阳性率为6.4%,vWF阳性率为97.42%,VEGFR2阳性率为93.21%。同时,所获得的内皮祖细胞可以能够吞噬乙酰化低密度脂蛋白,并与荆豆凝集素-1结合,荧光倒置显微镜下表现为同时发出红色及绿色荧光。此外,所获内皮祖细胞通过细胞增殖实验验证其具有增殖能力,均说明所获细胞纯度较高;2.使用Gα13的质粒或siRNA Gα13转染内皮祖细胞48小时后,通过流式细胞术检测转染效率达83.34%,PCR检测过表达后内皮祖细胞Gα13表达水平明显提高,而下调后内皮祖细胞Gα13表达水平下降,说明所得内皮祖细胞经过调控Gα13表达后可以用于后续功能实验。使用调控Gα13表达后的内皮祖细胞进行wound healing及transwell实验,以上两个实验均证实过表达Gα13后内皮祖细胞迁移能力增强(p<0.05),反之,下调Gα13后内皮祖细胞迁移能力降(p<0.05);CCK法检测过表达Gα13以及下调Gα13内皮祖细胞的增殖能力改变,结果显示上调或下调内皮祖细胞中Gα13表达后,其增殖能力差异无统计学意义;3.过表达内皮祖细胞中Gα13的水平后,通过western blot检测显示内皮祖细胞中RhoA、ROCK及MLC表达水平升高,反之,下调内皮祖细胞中Gα13表达水平后,内皮祖细胞中RhoA、ROCK以及MLC表达水平降低且差异具有统计学意义(p<0.05)。结论:1.通过密度梯度离心法所获得单个核细胞,经差速贴壁法和内皮祖细胞专用培养基定向诱导培养后可以获得纯度较高的内皮祖细胞,表达内皮祖细胞特征性表面标志物(CD31、CD133、vWF、VEGFR2)且具有吞噬乙酰化低密度脂蛋白以及结合荆豆凝集素-1的能力;2.上调内皮祖细胞G蛋白亚单位Gα13的表达水平可以促进内皮祖细胞迁移能力,反之下调内皮祖细胞中Gα13表达水平对其迁移能力有抑制作用。同时,调控内皮祖细胞中Gα13表达后对其增殖能力无明显影响;3.过表达内皮祖细胞中Gα13的含量水平,可以促进RhoA/ROCK1信号通路的激活,进而增强内皮祖细胞的迁移能力;反之,下调内皮祖细胞中Gα13的表达水平,可以降低RhoA/ROCK1信号通路的活性,抑制内皮祖细胞的迁移能力。