甘草作为我国最常用的大宗药材之一,始载于《神农本草经》,在中国有着两千多年的药用历史,具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药等作用。2015版《中华人民共和国药典》明确规定按干燥品计算,甘草样品中甘草苷(C21H22O9)的含量不得低于0.50%。本课题组前期调查研究发现:大量栽培甘草中甘草苷的含量难以达到药典规定的最低标准,严重影响栽培甘草的质量。因此,本课题首先采用X射线辐照处理甘草种子,以期通过基因突变快速获得优质高产的甘草栽培品。为进一步阐释乌拉尔甘草黄酮代谢途径的分子机制:一方面从甘草苷生物合成关键功能基因CHS和CHI的基因多态性进行分析;另一方面挖掘其转录组数据,解析影响甘草黄酮类化合物生物合成途径的主要差异表达基因。本论文采用6个梯度X射线辐照处理乌拉尔甘草种子,栽培一年后,利用HPLC法对获得的188株甘草样品中4种主要黄酮类化合物(甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素)进行含量分析,筛选出5株黄酮含量及产量较高的辐照甘草样品以及5株黄酮含量及产量较低的空白样品作为功能基因分析的实验材料。采用RT-PCR法对10株乌拉尔甘草样品进行CHS和CHI的基因多态性分析,筛选出黄酮高/低含量组样品的CHS和CHI主流单倍型;利用生物信息学软件对主流CHS和CHI基因单倍型进行分析,以解析功能基因多态性对黄酮类化合物生物合成的影响。进一步筛选出2个黄酮类含量及产量较高的辐照甘草样品和1个黄酮类含量及产量较低的空白甘草样品进行转录组分析,获得影响甘草黄酮类化合物生物合成的5条代谢途径,并对其差异表达基因进行qRT-PCR基因相对表达量分析。本论文取得的研究结果如下:(1)X射线辐照处理对乌拉尔甘草黄酮类化合物积累水平的影响研究运用HPLC法对188株甘草样品中的甘草苷、异甘草苷、甘草素和异甘草素进行含量测定,并计算其产量。结果发现:大部分辐照甘草样品中甘草苷、异甘草苷的含量和产量均显著高于空白对照,且随着辐照剂量的提高,其含量和产量总体呈现先上升再下降再上升的趋势。综合比较,50Gy辐照剂量组的黄酮类成分产量最优。以黄酮类化合物高含量和高产量为指标,筛选出5个X射线辐照处理甘草样品:A6-1、B6-2、B6-4、C1-1、C3-4;以黄酮类化合物低含量、低产量为指标,在空白对照中挑选出5个样品:AO-2、BO-1、B0-3、C0-2、C0-3,进行进一步的功能基因多态性分析。(2)X射线辐照处理对甘草查尔酮合酶基因多态性的影响研究采用RT-PCR法,以乌拉尔甘草辐照样品B6-2、B6-4、C1-1和乌拉尔甘草空白样品BO-1、B0-3、C0-2为实验材料,共克隆得到115条CHS基因cDNA序列,全长均为1175bp,包含1个完整的开放阅读框,编码389个氨基酸残基。确定了91种CHS单倍型,65种CHS氨基酸序列类型。空白对照组中存在54种单倍型,其中单倍型24为主流单倍型,编码氨基酸序列类型AA-13。辐照处理组中存在37种单倍型,其中单倍型61为主流单倍型,编码氨基酸序列类型AA-47;单倍型54出现频次也较高,其编码氨基酸序列类型AA-48。氨基酸变异位点分析发现:193位点的V/I变异,229位点的I/V变异,383位点的I/V变异可能影响黄酮的积累水平。(3)X射线辐照处理对甘草查尔酮异构酶基因多态性的影响研究采用RT-PCR法,以乌拉尔甘草辐照样品A6-1、B6-2、B6-4、C1-1、C3-4和乌拉尔甘草空白样品A0-2、B0-1、B0-3、C0-3为实验材料,共克隆得到173条CHI基因cDNA序列,全长均为690bp,包含1个完整的开放阅读框,编码229个氨基酸残基。共确定了111种CHI单倍型,89种CHI氨基酸序列类型。空白对照组中存在47种单倍型,其中单倍型68为主流单倍型,编码氨基酸序列类型AA-57。辐照处理组中存在67种单倍型,其中单倍型3为主流单倍型,编码氨基酸序列类型AA-3。CHI氨基酸序列的82位点D/E突变可能与黄酮含量积累水平有关。(4)甘草黄酮高/低含量组特异CHS氨基酸序列生物信息学分析对空白甘草样品CHS主流氨基酸序列类型AA-13以及辐照处理甘草样品CHS主流氨基酸序列类型AA-47及AA-48进行生物信息学分析,发现其物理化学性质相近。AA-13与AA-47的二级结构及三级结构较为接近,均与AA-48存在差异。三者均不含信号肽,位于膜外,无跨膜结构域,推测CHS不是分泌型蛋白而是留在细胞质中催化合成类黄酮等物质。此外,不同物种间CHS序列区分度良好。根据模建蛋白的结合位点预测,甘草黄酮高含量组主流氨基酸序列类型AA-47的383位缬氨酸是蛋白结合位点,能够与香豆酰辅酶A结合。甘草黄酮高含量组的主流氨基酸序列类型AA-48的229位缬氨酸是蛋白结合位点,能够与丙二酰辅酶A结合。而甘草黄酮低含量组主流氨基酸序列类型AA-13的229位和383位的异亮氨酸均不是蛋白结合位点。(5)甘草黄酮高/低含量组特异CHI氨基酸序列生物信息学分析对空白甘草样品CHI主流氨基酸序列类型AA-57以及辐照处理甘草样品CHI主流氨基酸序列类型AA-3进行生物信息学分析,发现两者物理化学性质相近,二级结构和三级结构均相似。两者均不含信号肽,位于膜外且无跨膜区,推测CHI不是分泌型蛋白而是留在细胞质中催化合成类黄酮等物质。此外,不同物种间CHI序列区分度良好。AA-3在82位点为天冬氨酸(D),AA-57在82位点为谷氨酸(E)。82位点D/E变异仅出现在空白对照组氨基酸序列中。但通过模建蛋白结合位点预测,发现AA-3与AA-57的82位点氨基酸残基均不是底物结合位点。(6)黄酮类化合物差异积累的乌拉尔甘草样品转录组分析高含量高产量辐照组乌拉尔甘草样品C3-4、B6-4和低含量低产量空白组乌拉尔甘草样品B0-1分别重新命名为H1、H2和L1。获得这3个乌拉尔甘草样本的转录组数据,其正确率高,基因组覆盖率良好。获得了3795个以上新转录本,丰富了甘草的基因库。基因表达水平分析发现:3个样本间的差异较大,H1与L1、H2与L1两两比较,分别获得了4527和4230个差异基因,2个比较组共有1875个核心差异基因。H1和H2样品的核心差异基因表达模式基本一致,而L1样品表达上调的基因多于H1和H2。因此推测辐照处理可能影响甘草基因表达水平,从而影响甘草黄酮类化合物的积累。共确定5条代谢途径上的核心差异基因与黄酮类化合物生物合成密切相关,包括:黄酮类化合物代谢途径、萜类代谢途径、植物激素信号转导途径、植物昼夜节律调控通路、淀粉和蔗糖代谢途径。5条代谢途径上的核心差异基因如下:在甘草黄酮类代谢途径上,共获得23个核心差异基因。其中H1和H2共同下调基因10个,包括:1个苯丙氨酸解氨酶基因,1个β-葡萄糖苷酶基因,1个咖啡酸3-0-甲基转移酶基因,2个松柏醛脱氢酶基因和5个过氧化物酶基因。苯丙氨酸解氨酶是苯丙素生物合成途径的关键酶,辐照样品H1和H2中编码该酶的基因表达量下调则表明辐照处理可能抑制了该酶的表达,从而影响黄酮类化合物的积累。此外,相对于L1而言,H1中的2个查尔酮合酶基因表达显著上调,该基因为甘草黄酮合成途径上的关键酶基因,极大影响黄酮类化合物的生物合成。下游旁路途径的β-葡萄糖苷酶、松柏醛脱氢酶和过氧化物酶的基因表达均下调,表明苯丙素类代谢途径上的反应底物大多流向黄酮合成途径,从而导致辐照样品中黄酮类化合物大量积累。在萜类代谢途径上,共获得9个核心差异基因。其中H1和H2共同上调基因有5个,分别为1个9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶基因,该基因编码脱落酸,与黄酮类化合物积累相关;1个赤霉素2-氧化酶基因和2个赤霉素3-β-双加氧酶基因具有调节植物光合作用,影响植物初生代谢功能,从而为黄酮等次生代谢产物积累提供底物;1个1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因上调,促进单萜、二萜和类胡萝卜素生物合成。H1和H2共同下调基因仅1个,即辣椒红素合成酶基因,该基因下调有利于脱落酸的合成,促进黄酮类化合物的积累。在植物激素信号转导通路上,共获得18个核心差异基因。其中H1和H2共同上调基因有3个,分别为蛋白运输抑制基因、赤霉素受体GID1基因和茉莉酸甲酯-结构域蛋白5基因。前二者基因表达上调,促进蛋白泛素化和二萜生物合成。茉莉酸甲酯-结构域蛋白5基因则诱导植物茎成熟和抗胁迫作用,表明辐照处理可能加快了植物成熟并促进植物抗逆能力。其中H1和H2共同下调基因有10个,分别为4个SAUR生长素超家族反应蛋白基因,1个生长素反应性GH3家族蛋白基因,3个吲哚乙酸诱导蛋白10基因,1个含有组氨酸的磷酸转移因子5基因和1个响应调节器4基因。前三者下调,表明生长素合成代谢下调。后两者下调,表明细胞分裂素合成代谢下调。生长素、细胞分裂素合成代谢下调,则植物生长缓慢,可能反映了辐照植物早熟状态。此外,基于生长-分化平衡假说、最佳防御假说和资源获得假说,生长缓慢则初级代谢下调而次级代谢上调,从而促进黄酮类化合物的生物合成。在植物昼夜节律途径上,共获得7个核心差异基因,在辐照样品H1和H2中表达均上调,分别为1个查尔酮合酶基因,3个伪响应调节器5基因,2个开花蛋白FT基因和1个生物钟基因。前两者分别与甘草抗X射线辐照作用和反馈调节作用相关。后两者与植物花期调控相关,进一步反映了辐照处理可能使花期提前,而花期中花色素等黄酮下游产物会影响黄酮类化合物生物合成。在淀粉蔗糖代谢途径上,共获得4个核心差异基因。在H1和H2中共同上调的基因有2个,分别是1,4-α-葡聚糖分支酶基因和β-淀粉酶基因,促进糊精、麦芽糖生成。在H1和H2中共同下调的基因有2个,分别是α-淀粉酶基因和蔗糖合酶基因。前者下调,则有利于淀粉向糊精、麦芽糖转化,后者下调,则蔗糖合成下调。综上,辐照甘草中多糖向单糖转化上调,为次生代谢产物形成糖苷提供基础。(7)乌拉尔甘草转录组核心差异基因相对表达量分析利用实时荧光定量PCR对12个核心差异基因的表达量进行验证。苯丙氨酸解氨酶基因PAL(Glyur000106s00011717)、查尔酮合酶基因 CHS1(Glyur000424s00026890)、CHS2(Glyur006062s00044203)、9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶基因NCED(Glyur000278s00017280)、赤霉素2-氧化酶基因GA20x(Glyur000261s00014360)、赤霉素受体基因GID1(Glyur000158s00011331)、生长素超家族反应蛋白基因SAUR(Glyur000017s00002448)、β-淀粉酶基因AMYB(Glyur000047s00004005)、咖啡酸3-0-甲基转移酶基因COMT(Glyur000116s00009246)、茉莉酸甲酯-结构域蛋白5基因JAZ(Glyur002299s00036262)、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因DXS(Glyur000231s00022061)和生物钟基因LHY(Glyur000116s00009244)。除DXS和COMT基因外,其他基因表达量的验证结果与转录组表达量分析结果一致。