论文部分内容阅读
目的：本实验拟于糖尿病视网膜病变模型及人脐静脉血管内皮细胞模型上，分析糖尿病视网膜病变过程中mir-126表达谱的变化，并通过MTT、q-PCR的方法、以血管新生情况、血管因子及其受体的mRNA表达的变化为指标，研究mir-126对其目标基因表达的调控情况，以揭示mir-126在糖尿病视网膜病变中的分子调节机制。 方法：⑴糖尿病视网膜病变模型制备:健康雄性昆明小鼠:体重10-15g，随机分为实验组和对照组。给予小鼠禁食禁水6小时后，按60mg/kg的剂量腹腔内注射1％链脲佐菌素(STZ)，1％STZ必须使用前新鲜配制，给STZ后24小时及一周用尾静脉针刺法采血测血糖，两次血糖均高于16.7mol/L的为造模成功。⑵mRNAq-PCR测定:将小鼠视网膜组织提取的总RNA样品应用DNA酶1处理后，对其进行常规实时定量RT-PCR的测定。采用Taqman定量测定法，应用实时定量两步逆转录PCR对VEGF及其受体的转录物的mRNA产物进行含量测定。其中，使用GAPDH作为内参。⑶以培养人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)为细胞模型，分为对照组及终末糖基化产物刺激组，晚期糖基化产物刺激浓度为200mg/L，分别孵育30 min、1h、3h、6h、12h、24h、48h后消化、收集细胞，提取总RNA用MTT、q-PCR的方法验证mir-126的变化。 结果：本实验通过对动物模型视网膜组织进行的一系列检测得出，糖尿病小鼠视网膜血管瘤在18周左右出现，而且随着病程延长，视网膜血管病变越显著。所以我们的实验周期延长，最长可至32周。在STZ诱导的糖尿病鼠模型视网膜中VEGF的表达上调，同时mir-126的表达也呈现上调趋势。在细胞水平上，利用高糖培养HUVEC，选取不同的时间点30min、1h、3h、6h、12h、24h、48h进行相关检测得出，VEGF的表达在所有时间点中表达均上调;mir-126在30min、1h表达下调，3h开始呈上调趋势，6h、12h、24h、48h表达上调。在动物模型中，随着糖尿病视网膜病变小鼠造模成功时间的延长，VEGF以及mir-126的表达水平均呈升高的趋势。 结论：确定了mir-126在糖尿病视网膜疾病的发生发展中调控血管新生，从而对糖尿病视网膜病变的发病机制提出了新的认识，并可能为糖尿病视网膜病变的基因诊断和治疗提供基于miRNA的新技术平台。mir-126与糖尿病视网膜病变发展过程中VEGF的作用相关，未来可以利用mir-126进行糖尿病视网膜病变的治疗。