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研究背景 内皮细胞（Endothelial cells,EC）是心血管系统的重要组成部分,EC的损伤,过度激活和功能障碍通常是心血管疾病病因的一部分。动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）是心血管疾病（CVD）的主要原因,是一种慢性炎症。动脉粥样硬化不再被认为是一种脂质积累的紊乱,而是一种以内皮功能障碍、内皮下炎症和血管平滑肌细胞创面愈合反应之间的动态相互作用为特征的疾病过程。动脉粥样硬化主要发生在许多大中型动脉的内膜,尤其是血管分叉处。内皮受到刺激活化并表达粘附分子,使单核白细胞,如单核细胞和T细胞,附着在内皮上并渗透到内膜。另外还有树突状细胞、肥大细胞、少量中性粒细胞和B细胞也可出现在病灶中。IL-1β作为一种炎症细胞因子,参与了动脉粥样硬化发生发展的过程。c-Rel是NF-κB家族中的一员,在B细胞和T细胞中高度表达。据报道c-Rel影响B细胞的成熟,增殖和存活并且在免疫反应及炎症中产生作用。但至今未尚未报道在动脉粥样硬化的炎症反应中的作用。N~6–methyladenosine（m~6A）是真核细胞中最普遍和最丰富的内部转录后RNA修饰类型。m~6A修饰是动态地、可逆地通过甲基转移酶（writers）、去甲基酶（erasers）和m~6A阅读器蛋白（readers）介导的。m~6A甲基化通过影响m RNA代谢的许多方面调控基因表达,包括pre-m RNA加工、核输出、衰变和翻译。大约1/4的转录本携带m~6A修饰,集中在终止密码子附近,主要集中在共识基序RRACH（R=A或G,H=A,C或U）的5’和3’非翻译区（UTRs）的长内显子内。据报道,m~6A修饰与心血管疾病的发生发展密切相关,包括心肌肥厚、心力衰竭、缺血性心脏病、主动脉瘤、血管钙化、肺动脉高压等。有报道,m~6A RNA修饰可能通过影响血管内皮细胞、巨噬细胞、SMCs等与斑块发生相关的细胞参与动脉粥样硬化的进展。我们推测炎症因子IL-1β通过METTL3调控c-Rel的表达,从而影响内皮细胞增殖、迁移等功能。鉴于此,我们提出科学假设:IL-1β影响HUVECS的METTL3的表达,通过IGF2BP3与c-Rel的结合,促进c-Rel m RNA的稳定性,增加c-Rel蛋白的表达,影响内皮细胞的增殖迁移等功能,加速AS的发展。研究目的本课题探讨IL-1β诱导内皮损伤后,METTL3调控的m~6A修饰在动脉粥样硬化发生发展中的作用机制。方法1.探讨IL-1β对HUVECs中炎症反应和功能的影响。（1）用100ng/ml的IL-1β处理HUVECs 48h后,收集蛋白通过Western Blot检测炎症相关分子,RNA结合蛋白,甲基化酶及m~6A阅读器蛋白的表达。同时收集RNA通过RT-q PCR检测METTL3及c-Rel的RNA水平。（2）用100ng/ml的IL-1β处理HUVECs 48h后,收集RNA,通过Dot Blot实验检测IL-1β刺激后HUVECs的甲基化的变化程度。（3）用100ng/ml的IL-1β处理HUVECs 48h,分别在30min、60min、90min、120min时向处理组和对照组加入5ug/ml的Actinomycin D,随后收集不同时间段的RNA进行PCR和RT-q PCR检测c-Rel m RNA的稳定性。（4）通过Transwell实验、细胞划痕实验、CCK-8细胞活力检测IL-1β处理48h后对HUVECs增值迁移能力的影响。2.探讨METTL3介导的RNA甲基化对c-Rel的影响。（1）使用METTL3 si RNA敲低METTL3后分别通过Western Blot和RT-q PCR检测c-Rel蛋白和RNA的表达水平;同时收集RNA通过Dot Blot实验检测敲低METTL3后HUVECs的甲基化水平;另外通过Transwell实验、细胞划痕实验及CCK-8细胞活力检测敲低METTL3对HUVECs增殖迁移功能的影响。（2）使用腺病毒过表达METTL3后分别通过Western Blot和RT-q PCR检测c-Rel蛋白和RNA的表达水平;同时收集RNA通过Dot Blot实验检测过表达METTL3后HUVECs的甲基化水平;另外通过Transwell实验、细胞划痕实验及CCK-8细胞活力检测过表达METTL3对HUVECs增殖迁移功能的影响。（3）利用生信软件分析预测IGF2BP3和c-Rel m RNA的结合位点,通过Biotin-Pulldown实验探讨IGF2BP3和c-Rel m RNA的具体结合位点。随后用IL-1β处理48h后,通过Biotin-Pulldown实验探究IL-1β处理后IGF2BP3和c-Rel m RNA结合的变化。3.探究c-Rel在IL-1β影响的HUVECs迁移功能中的作用。（1）利用c-Rel si RNA敲低c-Rel之后分别通过Western Blot和RT-q PCR检测敲低的效率。（2）通过Transwell实验、细胞划痕实验检测c-Rel在IL-1β诱导的HUVECs迁移功能中的作用。结果1.IL-1β处理HUVECs后炎症相关分子表达升高,同时与RNA甲基化相关的METTL3的表达升高,RNA甲基化水平升高,并且IL-1β通过增加c-Rel m RNA稳定性来上调c-Rel的表达;同时IL-1β的处理抑制HUVECs的增殖及迁移功能。差异具有统计学意义（p﹤0.05）。2.使用METTL3 si RNA敲低METTL3后,HUVECs的甲基化水平及c-Rel的表达水平下降,同时促进HUVECs的增殖迁移;使用腺病毒过表达METTL3之后,HUVECs的甲基化水平及c-Rel的表达水平升高,同时抑制HUVECs的增殖迁移。差异具有统计学意义（p﹤0.05）。3.通过生物信息分析预测c-Rel m RNA CR段有丰富的甲基化位点,猜测可能会与m~6A阅读器蛋白有结合,并通过Biotin-Pulldown证明IGF2BP3与c-Rel m RNA的CR段结合,并且IL-1β会增加IGF2BP3与c-Rel m RNA的CR段的结合。差异具有统计学意义（p﹤0.05）。4.使用c-Rel si RNA敲低c-Rel后,可以恢复IL-1β对HUVECs迁移功能的抑制作用。结论在HUVECs中,IL-1β通过增加METTL3的表达,从而增加RNA甲基化水平,同时使m~6A阅读器IGF2BP3与c-Rel m RNA的结合增加,增加c-Rel m RNA的稳定性,上调c-Rel的表达以及影响内皮细胞的增殖迁移功能。