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目的：微管是构成细胞骨架的主要组成成分之一,其对于细胞的各种主动运动至关重要,这包括细胞形态的改变、细胞的移动、染色体的分离和细胞的分裂等。细胞中各种微管结构和功能的差异决定于其亚细胞定位及其与之结合的微管结合蛋白。Stathmin就是一个已经明确的使微管失稳定的微管结合蛋白,它通过促使微管解聚和隔离组成微管的Tubulin亚基而使微管失稳定,多种激酶可以通过磷酸化和去磷酸化而使Stathmin蛋白的微管失稳定活性失活和活化。鼻咽癌是中国人群特有的高发肿瘤,EB病毒的感染与鼻咽癌的发生发展密切相关,EB病毒编码的潜伏膜蛋白LMP1是一个已经确认的瘤致蛋白质。前期的研究发现Stathmin是LMP1调控网络中的一个下游分子,LMP1可以通过多条通路调节Stathmin的磷酸化,使微管失稳定而促使细胞永生化、增强肿瘤细胞增殖、转移和侵袭。siRNA是人工RNAi技术中一个重要小分子,其可以激发与之互补的目标mRNA的沉默。具有高特异性、高效率、可遗传等重要特性。本研究以期通过构建的靶向Stathmin的siRNA质粒沉默其蛋白质的表达,降低微管的解聚,增强微管的聚合,从而促使肿瘤细胞凋亡、抑制其增殖、转移和侵袭。紫杉醇是作用于细胞微管的主要抗肿瘤药物之一,它通过促进微管聚合,抑制其解聚,保持微管稳定,抑制细胞有丝分裂,具有显著的放射增敏作用,有着与靶向Stathmin的siRNA类似的作用。因此,本研究拟通过二者联合应用以期放大它们对肿瘤细胞的生物学效应。方法：本文以鼻咽癌细胞CNE1-LMP1为研究模型,用本实验室构建的靶向Stathmin的siRNA质粒为策略,探讨靶向Stathmin的siRNA抑制其蛋白质的表达而对鼻咽癌细胞的凋亡和增殖、侵袭和迁移的影响,并评价Stathmin的siRNA与抗微管化疗药物联合应用的效应。本研究首先以RT-PCR和Western blot证实本研究所应用的靶向Stathmin的siRNA质粒可否抑制鼻咽癌细胞CNE1-LMP1的Stathmin的mRNA和蛋白质的表达水平。以MTT实验证实靶向siRNA对鼻咽癌细胞生长增殖的抑制作用。利用流式细胞术确定靶向Stathmin的siRNA诱导鼻咽癌细胞的凋亡、细胞周期和线粒体膜电位的改变,以AO/EB染色和TUNEL实验证实其对鼻咽癌细胞凋亡的诱导作用,以Western blot检测siRNA转染后细胞凋亡标志性蛋白质Caspase的变化,以期确认鼻咽癌细胞的凋亡及凋亡途径。其次,以Western blot检测转染靶向Stathmin的siRNA的鼻咽癌细胞中可溶性微管和聚合性微管比例的变化。以间接荧光染色检测该siRNA质粒对微管多聚化的调节作用。以划痕实验检测该siRNA对鼻咽癌细胞在二维平面上迁移能力的影响。以Transwell检测该siRNA对鼻咽癌细胞在三维基质中迁移和侵袭能力的调节。再次,以MTT实验检测转染靶向Stathmin的siRNA和紫杉醇联合应用对鼻咽癌细胞增殖作用的影响。以流式细胞术检测二者联合应用对细胞的促凋亡作用和细胞周期的改变。以间接荧光法和Western blot检测转染该siRNA和紫杉醇联合应用对鼻咽癌细胞微管产生影响。最后,以RT-PCR和Western blot检测紫杉醇对鼻咽癌细胞以及其它多种高表达Stathmin细胞A375、MGC和Hela中Stathmin表达在mRNA和蛋白水平的调节作用。结果：首先,RT-PCR和Western blot实验证实了本研究所用的靶向Stathmin的siRNA质粒可以明显抑制鼻咽癌细胞Stathmin的mRNA和蛋白质表达水平。MTT实验检测细胞的生长曲线显示该siRNA的转染对鼻咽癌细胞的增殖也有明显的抑制作用。流式细胞术分析显示该siRNA可明显促进鼻咽癌细胞的凋亡(达到30.9%),使肿瘤细胞阻滞于G2/M期(16.3%)。同时,AO/EB染色、TUNEL实验以及Western blot检测凋亡标志性蛋白Caspase-3、8和9也进一步证实该siRNA对细胞凋亡的促进作用。并且,Caspase和线粒体膜电位的检测也明确该siRNA是通过线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡的。其次,Western blot证实向鼻咽癌细胞转染靶向Stathmin的siRNA可明显增加细胞的聚合性微管的量而减少可溶性微管,使得聚合性微管／可溶性微管的比值明显提高(P/S=3.43)；间接免疫荧光也显示转染siRNA的细胞微管长而成束,荧光强度明显提高。虽然二维的划痕实验并没有显示转染了该siRNA的鼻咽癌细胞运动能力有明显的改变,但Transwell实验显示转染该siRNA的细胞迁移和侵袭能力都受到明显抑制。再次,将靶向Stathmin的siRNA质粒和紫杉醇联合应用于鼻咽癌细胞CNE1-LMP1。MTT实验显示联合应用对细胞增殖的抑制效果明显高于其中任何一种方式的单独应用。而且,转染了该siRNA的细胞,其细胞增殖的受抑制的程度与紫杉醇在一定的浓度范围内有剂量关系。间接免疫荧光实验同样显示虽然二者单独应用都可以一定程度上使被处理的细胞微管变粗和变长,荧光强度有所增强,但二者联合应用的结果显示出微管变得更粗和更长,荧光强度更强。同样,Western blot检测细胞的可溶性和聚合性微管的量也显示虽然二者单独应用都可以一定程度上使被处理细胞的聚合性微管增加,可溶性微管减少,聚合性微管／可溶性微管的比值有所增加。但二者联合使用,细胞中的聚合性微管增加和可溶性微管减少的程度要明显的多,聚合性微管／可溶性微管的比值显著提高(P/S=2.05)。最后,研究还发现在鼻咽癌细胞以及其它多种高表达Stathmin的肿瘤细胞中,紫杉醇对细胞中的Stathmin表达有明显的抑制作用,而且,在鼻咽癌细胞中,这种抑制作用与紫杉醇的浓度有一定的剂量效应。结论：靶向Stathmin的siRNA通过抑制其蛋白质的表达而抑制鼻咽癌细胞的增殖,迁移和侵袭,并通过线粒体途径促进细胞凋亡。这种对鼻咽癌细胞凋亡和增殖,迁移和侵袭的调控是通过增强微管的聚合而减少其降解,使微管多聚化、使微管稳定而实现的。紫杉醇可下调Stathmin的表达,靶向Stathmin的siRNA与化疗药物紫杉醇对鼻咽癌细胞有联合治疗效应。这将为鼻咽癌临床的化学治疗提供了一条新的启示。