目的:脊髓损伤(SCI)是脊柱外科和神经科学领域的一种严重的运动系统致残性疾病,目前尚缺乏有效的治疗方法。中医药具有多因素和多靶点的治疗优点,治疗SCI作用确切,且具有特色优势。温肾通督方——“脊髓康”是基于SCI“肾虚督损,督脉瘀阻,枢机统率失职”病机而筛选出具有“温肾通督,祛瘀利湿,调和气血”之功效的临床经验方。前期研究表明,“脊髓康”促进SCI修复作用肯定,因此为了更深层次的研究,对“脊髓康”治疗SCI的作用机制进行研究和探索十分必要,以期可充分地阐明中医理论治疗SCI的科学性,探索中医药促进神经功能恢复的治疗策略。方法:中药复方“脊髓康”药物组成复杂,且临床使用形式为中药水煎剂,为了深入剖析该方药物组成之间的潜在联系与相互作用,以便科学地精简处方、优化水提方式,提高后续实验的可重复性,故通过高效液相法对本方水提物的化合物图谱进行建立和定量分析;同时,通过应用双荧光素酶报告基因系统的靶向筛选平台针对IRE1/XBP1通路进行“脊髓康”有效组份化合物的筛选,为后续“脊髓康”抗SCI机制研究打下基础。为了进一步明确“脊髓康”及有效组份抗内质网应激保护神经元的机制,运用流式细胞术、CCK8、Westernbloting、q-PCR及透射电镜扫描,共同验证“脊髓康”全方及有效性拆方介导调控内质网应激IRE1/XBP1通路抗神经元凋亡的有效性。此外,通过观察“脊髓康”及有效拆方组份对小胶质细胞吞噬神经元碎片吞噬效率的影响,进一步为“脊髓康”抗SCI提供进一步的实验依据,并拓展了中药方剂干预SCI的研究领域。结果:通过HPLC法对中药复方“脊髓康”进行成分检测,初步建立质控成分,共检测出16种成分化合物,分别是阿魏酸、没食子酸、淫羊藿苷、大黄素、大黄酚、芦荟大黄素、大车前苷、丹酚酸A、原儿茶醛、松果菊苷、木兰花碱、槲皮素、大黄酸、丹酚酸B、橙皮苷、芍药苷。运用双荧光素酶报告基因系统的靶向筛选平台进行了针对IRE1/XBP1通路筛选的“脊髓康”有效性拆方组份,结果发现丹酚酸B、松果菊苷、大车前苷、橙皮苷、淫羊藿苷、芍药苷和芦荟大黄素可高效促进XBP1剪接活化,特异性针对IRE1/XBP1通路对内质网应激进行处理。CCK8、SRB、流式细胞术检测的实验结果均显示,毒胡萝卜素可激动内质网应激促使经NGF诱导的神经元样PC12细胞发生凋亡,且凋亡率较高;而有效拆方组、脊髓康组、淫羊藿苷组方中药物可改善毒胡萝卜素诱发的内质网应激,减少神经元样PC12细胞凋亡。Western Bloting和q-PCR结果显示,毒胡萝卜素作为ESR激动剂,确实能够上调内质网伴侣分子Grp78和ESR信号通路中相关分子XBP1、IRE1的蛋白和mRNA表达;同时经脊髓康组、有效拆方组及淫羊藿苷组干预后Grp78表达降低(P<0.05)而XBP1、IRE1蛋白和mRNA表达上调(P<0.05)。电子透射显微镜对内质网显微结构的观察显示,胡萝卜素诱导刺激后神经元样PC12细胞内质网结构混乱,并出现明显凋亡改变,而有效拆方组、脊髓康组、淫羊藿苷组方中药物均可改善内质网应激所导致的神经元样PC12细胞凋亡。通过观察小胶质细胞对神经元碎片吞噬的影响,发现有效拆方组、脊髓康组药物均不同程度地促进了小胶质细胞发挥吞噬神经元碎片作用。在吞噬百分比方面,有效拆方组、脊髓康组对比空白组差异具有统计学意义,与LPS组对比差异无统计学意义;而在吞噬指数方面,淫羊藿苷组、有效拆方组、脊髓康组与空白组对比差异均具有统计学意义。结论:温肾通督方——“脊髓康”有效治疗SCI的机制可能是通过特异性促进ERS后XBP1的剪接活化而达到保护受损神经元的作用。此外“脊髓康”和有效拆方组份能促进小胶质细胞发挥清道夫样作用,对神经元轴突碎片进行吞噬,从而促神经修复功能。