肠道菌群变化对CD8+T细胞PD-1和CD28表达影响的研究

来源 :皖南医学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:renrenxiaonei
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目的:初步探讨口服酪酸梭菌二联活菌可有效调节早产小鼠肠道共生微生物群的定植;探讨肠道定植共生微生物群变化可能通过调控T细胞协同刺激分子CD28和协同抑制分子PD-1表达调节早产小鼠免疫系统的发育和成熟。方法:1、动物模型建立:随机选取6-8周龄BALB/c成年小鼠,以2:1的雌雄比例合笼自然受孕,随机选取部分雌鼠于孕18天时腹腔注射米非司酮(RU486),连续两天,诱导早产,随机选取胎龄小于20天的小鼠为早产鼠模型;另随机选取自然分娩胎龄大于20天新生小鼠,为足月小鼠模型。2、分组和干预:选取早产鼠20只,随机分为早产实验组、早产对照组,随机选取足月小鼠模型为足月对照组,每组10只。早产实验组自生后第一天晨8点起予以10ul/g的酪酸梭菌二联活菌散灌胃,早产对照组和足月对照组自生后第一天晨8点起予以相同剂量的生理盐水灌胃,连续7天,在IVC环境下饲养,不加任何其他干预。3、标本留取:三组新生小鼠分别于出生后第14天(postnatal day 14,P14)和P21分别选取10只,经10%水合氯醛(剂量:0.3-0.4ml/100g)腹腔注射麻醉,采用摘眼球取血法取外周血至少100ul,使用EDTA-K2抗凝管抗凝,置于冰上备用。P21小鼠眼球取血后采用颈椎脱臼法处死,置于75%的酒精中浸泡20分钟,置于超净工作台,截取其中空肠、回肠和结肠部分,置盛有无菌PBS缓冲液的培养皿中,使用10ml无菌注射器充分冲洗肠内容物,充分混匀,吸取1-2ml肠内容物于无菌5ml EP管中,获粪便标本,无菌石蜡封口膜封口,随后迅速转移至液氮中冷冻24h,后放置于-80℃的生物样本储存超低温冰箱中保存备用。4、应用高通量测序(本实验由湖北武汉华大基因有限公司高通量测序实验室合作完成)检测肠道微生物丰富度、多样性及物种丰度的表达;采用流式细胞仪检测三组新生小鼠CD8+T细胞表面CD28和PD-1(PD-1)百分率及其平均荧光强度表达,最终采用流式分析软件Flow Jo X分析CD28和PD-1的表达。结果:1、P21,在属水平,三组间共24属差异有统计学意义(P<0.05),分别为来自厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门、疣微菌门、铁还原杆菌门。2、P14,三组新生小鼠外周血CD3+CD8+CD28+百分率及CD3+CD8+T细胞表面CD28MFI在三组间具有统计学意义(P<0.001)。CD3+CD8+CD28+百分率早产对照组高于早产实验组和足月对照组(P<0.05),CD3+CD8+CD28+百分率早产实验组高于足月对照组(P<0.05);CD3+CD8+T细胞表面CD28MFI早产实验组高于早产对照组和足月对照组(P<0.05),CD3+CD8+T细胞表面CD28MFI早产对照组高于足月对照组(P<0.05)。P21天时,三组新生小鼠外周血CD3+CD8+CD28+百分率及CD3+CD8+T细胞表面CD28MFI在三组间具有统计学意义(P<0.001),CD3+CD8+CD28+百分率足月对照组高于早产实验组和早产对照组(P<0.05);CD3+CD8+T细胞表面CD28MFI足月对照组高于早产对照组和早产实验组(P<0.05),CD3+CD8+T细胞表面CD28MFI早产实验组高于早产对照组(P<0.05)。3、P14天时,三组新生小鼠外周血CD3+CD8+PD-1百分率及CD3+CD8+T细胞表面PD-1MFI在三组间具有统计学意义(P<0.001),早产实验组高于早产对照组和足月对照组(P<0.05),早产对照组高于足月对照组(P<0.05)。P21天时,三组新生小鼠外周血CD3+CD8+PD-1百分率及CD3+CD8+T细胞表面PD-1MFI在三组间具有统计学意义(P<0.001),CD3+CD8+PD-1百分率早产实验组低于早产对照组和足月对照组(P<0.05),CD3+CD8+PD-1百分率足月对照组低于早产对照组(P<0.05),CD3+CD8+T细胞表面PD-1MFI足月对照组和早产实验组高于早产对照组(P<0.05)。结论:1、酪酸梭菌二联活菌可有效改善早产小鼠肠道微生物群丰富度、多样性及物种丰度;2、肠道定植微生物群丰富度、多样性及物种丰度的改变可能通过调控CD8+T细胞共信号分子CD28和PD-1的表达,在早产小鼠免疫系统的发育和成熟中发挥重要作用。
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