化学选择性修饰是研究蛋白质表达与功能的重要方法;近年来,研究人员发展了系列针对半胱氨酸,赖氨酸,甲硫氨酸等氨基酸残基的选择性修饰分子。将这类分子探针与活性导向蛋白谱学分析技术(activity-based protein profiling,ABPP)相结合,发现了系列高活性的氨基酸位点与新的药物作用靶标,为药物发现与疾病治疗提供了重要基础。生物体内酸性氨基酸残基包括谷氨酸和天冬氨酸,其残基数量占生物体系总氨基酸残基的比例高达12.1%,并且部分酸性氨基酸残基对维持蛋白质结构与功能起着关键的作用。然而,由于酸性氨基酸残基的亲核能力相对较弱,要在复杂的生物体内对酸性氨基酸残基实现选择性修饰仍然是一大挑战性课题。本论文结合课题组前期在酸性氨基酸修饰方面的研究基础,考察了各类含有羧酸作为反应物的化学反应。我们发现3-苯基-2H-氮杂环丙烯能够在温和条件下与羧酸发生分子间偶联反应。通过羧酸将氮杂环丙烯质子化,亲核加成和分子内的重排反应后生成稳定的N-乙酰基酰胺偶联产物。而其他的氨基酸残基不能使氮杂环丙烯质子化,由此我们推测氮杂环丙烯可以作为生物体内针对酸性氨基酸的选择性探针。为了验证这一设想,我们合成了一系列基于氮杂环丙烯的分子探针AZ-1～AZ-11,区别主要在于氮杂环丙烯的2、3位引入烷基或芳基,考察不同取代基对探针的标记效率和选择性的影响。我们首先通过核磁共振仪测试了探针在生理条件下的化学稳定性,实验结果证明探针室温下可以在水溶液中保存至少3天不降解。再利用高效液相色谱仪研究了AZ-11与各氨基酸侧链的反应活性,经核磁图谱确证,AZ-11与Boc保护的谷氨酸在PBS/四氢呋喃混合溶液中的反应产物是和我们设想一致的稳定N-乙酰基酰胺产物。然后通过高效液相色谱仪验证了AZ-11与多肽在2小时内即可完成反应,LC-MS/MS确证了探针修饰的位点是谷氨酸和天冬氨酸,证明了探针良好的标记效率与选择性。随后我们考察了探针在纯蛋白中的标记情况,标记实验显示多数探针能够在1小时内,2.5μM探针浓度显著标记各种重组蛋白,并且加入竞争剂能够有效减弱标记强度,证明了探针标记的有效性。细胞水平的标记实验证明AZ-9的标记能力要显著强于其他探针,说明2-位取代基团一定程度上能影响探针在细胞中对蛋白质的标记。并且在1小时内,2.5μM探针浓度依然能显著标记细胞中各类蛋白,证明了探针在细胞水平的良好标记效率。通过亲和层析(pull-down)结合生物质谱检测,证明了探针能够选择性标记蛋白质和活细胞中的酸性氨基酸位点,3-苯基-2H-氮杂环丙烯可以作为酸性氨基酸残基的选择性修饰探针。通过蛋白质晶体结构分析,我们发现探针标记的位点主要位于蛋白的口袋中,并且能够高选择性修饰功能性谷氨酸残基。通过与定量活性导向蛋白质谱学分析技术(ABPP)相结合,我们在乳腺癌细胞中发现了系列高活性的酸性氨基酸位点,为乳腺癌相关的药物开发提供了重要基础,这提示我们发展的新型反应基团—3-苯基-2H-氮杂环丙烯—可用于构建新型共价小分子抑制剂。