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N-糖基化是最重要最频繁的一种蛋白修饰,广泛存在于膜蛋白和分泌蛋白,对糖蛋白的化学性质、生理活性及免疫原性等至关重要。在真核细胞中蛋白质N-糖基化开始于内质网膜（ER）多萜醇寡糖前体（dolichol-linked oligosaccharide:DLO）的合成。DLO由14个单糖组成,它的生物合成由一系列糖基转移酶（asparagine-linked glycosylation:Alg）完成。目前虽然对DLO途径中的ALG基因都已克隆,但是对于这些糖基转移酶的生化功能解析长久以来几乎没有进展。在人体,Alg突变会导致先天性糖基化疾病（congenital disorders of glycosylation:CDG）,不同患者的疾病严重程度不一,从出生早期死亡到能够存活至成年很久均有报道。但是目前还没有一种方法能够建立不同的突变与疾病严重程度之间的相关性。另一方面,高甘露糖型寡糖作为N-糖基化修饰之中的一大类广泛应用到糖芯片、疫苗及糖蛋白质量控制等各种生物学研究。目前生产高甘露糖型寡糖的方法为化学合成或从天然来源中分离提取,但是这两种方法都存在耗时耗力和效率低下等缺点。为了解决上述的问题,本论文通过体外重构真核生物DLO合成途径,建立定量检测Alg活性的LC-MS方法,对Alg进行了详细的功能解析及CDG相关的突变研究;进一步的利用化学酶法高效的合成了高甘露糖型寡糖。本论文的主要研究结果如下:（1）建立LC-MS定量检测技术用于Alg1的酶学性质研究。Alg1催化第1个甘露糖（Man）到底物GlcNAc2-PP-Dolichol（DPGn2）上形成产物DPGn2-Man。论文首先化学合成了结构简单、水溶性好Alg1的替代底物:GlcNAc2-PP-Phytanyl（PPGn2）,原核表达纯化了酿酒酵母Alg1（35）TM（截掉N端跨膜域）,并结合LC-MS技术,建立了定量检测活性的方法。随后对Alg1进行了详细的生化性质研究;以及通过对ALG1-CDG对应于酿酒酵母的保守性突变蛋白的酶比活测定,揭示出了突变导致酶比活下降的程度与CDG疾病的严重程度具有相关性。（2）证明Alg2存在替代催化路线。ALG2编码一个双功能甘露糖基转移酶,同时催化?1,3及?1,6-Man连接到DPGn2-Man上,形成分支结构的3甘露糖核心DPGn2-Man3,但是对于2个不同糖苷键的反应顺序仍存在争议。目前认可的顺序为:先形成?1,3-Man中间产物后,再生成?1,6-Man完成催化,这与30年前报道同时存在两种中间产物的结果相矛盾。本研究首先原核表达纯化了酿酒酵母Alg2,建立了定量检测活性的LC-MS方法。利用灵敏的LC-MS技术和特异性甘露糖苷水解酶（Mannosidase）处理中间产物,首次揭示了Alg2能以不同的催化速率通过两种方式形成最终的产物DPGn2-Man3,即最优先的催化途径为:首先形成?1,3,再形成?1,6;另外,还存在催化速率相对较低的替代合成路线途径:先形成?1,6,再形成?1,3。进一步的通过体外及体内实验相结合,确证了EX7E motif、N-端细胞质区的短肽结构及3个G-loop motif对于Alg2的活性至关重要。（3）建立LC-MS定量检测技术用于ALG11-CDG的疾病严重程度研究。ALG11编码一个双功能甘露糖基转移酶,连续催化2个?1,2-Man到DPGn2-Man3上,生成DPGn2-Man5。本研究首先原核表达人Alg11,建立LC-MS定量分析活性的方法。检测了引起ALG11-CDG的7个突变Alg11的活性,揭示出了ALG11-CDG相关突变的活性下降程度与疾病的严重程度具有相关性。另外,鉴定了Alg11的EX7E motif和2个G-loop motif。（4）化学酶法合成高甘露糖型寡糖。通过原核表达一系列甘露糖基转移酶,体外重构了DLO途径生成PPGn2-Man9的过程,能够以90%以上的转化率高效的生产高甘露糖型寡糖。另外,通过不同甘露糖基转移酶的组合,合成了一系列不常见结构的高甘露糖型寡糖。