背景与目的:毒蛇咬伤（蛇伤）被世界卫生组织列为一个易忽视的重要的热带/亚热带疾病之一。我国每年因蛇伤的患者达30万人之多,而中华眼镜蛇咬伤位居我国毒蛇咬伤发病率的第二位,在广西则位于首位,临床上属于急重症。中华眼镜蛇咬伤临床表现为极易出现局部组织水肿或坏死甚至肌肉大面积坏死,严重者可致残甚至截肢。目前,由于缺乏良好的动物模型,以致对眼镜蛇咬伤后引起的生物体内病理生理方面的变化知之甚少,给治疗带来了不少的困难。因此,本研究以广西巴马小型香猪作为眼镜蛇咬伤的动物模型,首先建立一种合理、制作方便、安全性和稳定性较好的动物模型,以解决目前尚无眼镜蛇咬伤大型动物模型问题;然后采用非靶向与靶向代谢组学方法筛选、鉴定和验证眼镜蛇咬伤的血清代谢物图谱和差异代谢物,并结合眼镜蛇咬伤临床患者的血清标本对差异代谢物进行临床验证,以期从代谢物分子的角度揭示中华眼镜蛇咬伤的病理机制,探寻蛇伤中毒作用与机体应答之间的复杂相互作用关系,从而给予临床治疗中华眼镜蛇咬伤提供相应的分子病理学理论基础和潜在的治疗靶点。方法:1.中华眼镜蛇咬伤动物模型的构建以巴马小型香猪为研究对象,将眼镜蛇毒注射入小猪的腿外侧肌肉处,通过观察猪的生物学行为状态、病理学检查及相关血液生化指标综合评判构建的模型是否符合研究要求,并探索建模的最适蛇毒剂量。2.非靶向代谢组学的分析随机选择20头猪分为蛇毒组和对照组,蛇毒组注射建模的最适蛇毒剂量,采集猪血清进行代谢组学研究实验。采用UPLC-Q-TOF-MS非靶向代谢组学方法分析鉴定蛇伤中毒猪的血清代谢物图谱,同时进行OPLS-DA等多元统计分析和单变量统计分析以筛选差异代谢物,进一步采用生物信息方法对筛选出的差异代谢物进行聚类分析、相关性分析以及KEGG通路分析。3.靶向代谢组学的分析根据非靶向代谢组学结果并结合文献查阅,选取关键的差异代谢物进行靶向代谢组学分析:首先制定差异代谢物标准品标准曲线,确定定量结果;然后对蛇伤中毒猪的血清关键代谢物进行靶向代谢组学分析,把待测物相关参数与对应的标准曲线进行对比,得出定量的结果,采用t检验进行差异统计学分析,以验证差异代谢物可靠性。4.关键代谢物的临床验证采用靶向代谢组学对猪血清中获得的关键代谢物进行临床血清样本的验证。取眼镜蛇咬伤的患者血清及正常人的血清进行靶向代谢组学分析,将结果参数与对应的标准曲线进行对比,得到最终的关键代谢物定量结果。采用t检验对临床血清和正常人血清样本的关键代谢物含量进行统计学分析,以验证关键代谢物的可靠性与稳定性。结果:1.成功构建中华眼镜蛇咬伤小猪的动物模型模型的稳定性实验结果表明,小猪在注射0.75mg/kg蛇毒后,在30min出现神经毒素中毒现象,约3h之后出现细胞毒素中毒现象,与临床眼镜蛇咬伤中毒症状一致;血液指标表明,与对照组相比,蛇毒组小猪在注射蛇毒12h内,白细胞、超敏C反应蛋白、乳酸脱氢酶、肌酸激酶同工酶显著升高差异极为显著;组织病理染色结果显示,蛇毒组小猪的肌肉组织细胞核溶解,细胞质出现不规则排布的肌肉坏死现象;心肌细胞多呈浑浊肿胀,有不同程度的变形、坏死和凋亡;肝组织细胞有出血、坏死现象;脑组织中神经细胞发生肿胀。从以上行为学、病理和血液生化指标结果说明小猪的病理病程符合临床眼镜蛇伤中毒表现,说明构建的眼镜蛇咬伤动物模型符合要求。2.中华眼镜蛇咬伤猪的血清差异代谢物筛选和鉴定结果通过UPLC-Q-TOF-MS系统对20个血清样品中的代谢物信息采集,正离子模式下获得了5045个色谱峰,负离子模式下获得了3871个色谱峰。与正常组相比,蛇毒组正离子模式下鉴定并筛选了24个差异代谢物,其中3个差异代谢物含量上调,21个差异代谢物含量下降;负离子模式下筛选并鉴定了42个差异代谢物,其中12个差异代谢物含量上调,30个差异代谢物含量下降。两种模式下都存在的差异代谢物有8个,分别为L-精氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、马尿酸、甘氨胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、鹅去氧胆酸盐、肌苷,被列为关键代谢物。3.中华眼镜蛇咬伤猪的血清差异代谢物生物信息学分析结果通过与KEGG数据库匹配发现,小猪中毒后血清的差异代谢物主要富集在5条代谢通路,分别为ABC转运蛋白、癌症的中心碳代谢、蛋白质消化和吸收、氨酰t-RNA生物合成及矿质元素吸收。参与这些通路的差异代谢物主要为肌苷、L-谷氨酰胺、L-苯丙氨酸、D-脯氨酸、L-亮氨酸、L-精氨酸等。4.中华眼镜蛇咬伤猪的血清关键代谢物的靶向验证结果根据非靶向代谢组学正负离子的结果以及不同化合物在小猪体内的理化性质,最终选定肌苷、马尿酸、胸苷、谷氨酰胺4个关键代谢物在负离子模式下进行靶向代谢组学的绝对定量,同时选择鹅去氧胆酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、D-脯氨酸、L-精氨酸5个关键差异代谢物正离子模式下进行靶向代谢组学的绝对定量。检测结果显示,肌苷、马尿酸、胸苷、谷氨酰胺、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、D-脯氨酸、L-精氨酸8种代谢物在两组的含量均有差异（P＜0.05）,且同一种代谢物在蛇毒组、对照组及标准品的保留时间均保持一致,与非靶向的研究结果相同,表明得到靶向绝对定量验证。5.中华眼镜蛇咬伤关键代谢物的临床验证结果采用靶向代谢组学对8个关键代谢物进行临床血清样本的验证,结果表明,与正常人血清相比,患者血清中肌苷、L-苯丙氨酸、D-脯氨酸3种代谢物含量降低,定量结果与非靶向和靶向代谢组学的结果一致,且差异具有显著性差异（P＜0.05）,表明肌苷、L-苯丙氨酸、D-脯氨酸3种关键代谢物可能与眼镜蛇咬伤中毒的病理生理学机制密切相关。结论:1.本研究以广西巴马小香猪为动物模型,将0.75mg/kg的中华眼镜蛇毒注射小猪的腿部外侧肌肉处,6h后可获得中华眼镜蛇咬伤动物模型。2.非靶向代谢组学方法全面分析眼镜蛇咬伤小猪血液的整体代谢轮廓及靶向代谢组学的绝对定量验证中发现肌苷、马尿酸、谷氨酰胺、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、D-脯氨酸、L-精氨酸、胸苷8种差异代谢物在两组中的含量差异并得到了绝对定量验证。3.通过进一步对眼镜蛇咬伤临床患者血清样品进行关键代谢物靶向验证分析,发现肌苷、L-苯丙氨酸、D-脯氨酸3种代谢物在患者血清中含量降低,且差异有统计学意义（p＜0.05）,与小猪蛇伤中毒后血清的代谢物含量变化差异一致,充分说明这3种差异代谢物在眼镜蛇咬伤后的病理生理学过程中扮演重要角色。4.差异代谢物参与的代谢通路深入研究发现,眼镜蛇咬伤能影响机体内ABC转运体、癌症的中心碳代谢、蛋白质消化和吸收、氨酰t-RNA生物合成及矿质元素吸收等5条重要代谢通路,参与这些通路上的差异代谢物主要为L-精氨酸、谷氨酰胺、D-脯氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸。总之,本研究筛选、鉴定和验证获得的中华眼镜蛇咬伤的代谢物谱和差异代谢物,有望为临床治疗中华眼镜蛇咬伤提供相应的分子病理学理论基础和潜在的治疗靶点。