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研究背景及目的:原发性肝癌是典型的富血管肿瘤,肿瘤血管生成在肝癌生长与转移中起重要作用,而内皮细胞是肝癌血管生成的关键细胞;另一方面,抗血管生成治疗可抑制肝癌的生长、转移,其治疗的靶点也为血管内皮细胞。故研究肝癌血管内皮细胞就显得十分重要。应用体外培养的血管内皮细胞,可以构建各种实验模型来研究生理和病理情况下血管内皮细胞的基因、表型和功能,以及与各种组织细胞相互作用及其调控机制,鉴于血管内皮细胞之间的异质性,血管内皮细胞应该尽可能来源于不同疾病发生的组织或器官,研究肝癌血管内皮细胞也应如此。目前虽有肿瘤血管内皮细胞分离成功的报道,但其方法各有利弊,目前分离培养肝癌血管内皮细胞国内外未见报道。本实验意图通过借鉴其他正常及肿瘤组织血管内皮细胞的分离培养方法,建立人原发性肝癌血管内皮细胞的适宜的分离培养体系并对其细胞表型作一初步研究。本实验分三个部分:1用酶消化法、组织块贴壁法及血管内膜贴壁法分离培养血管内皮细胞,并采用简单三步骤纯化法纯化血管内皮细胞;比较三种方法的优缺点并探索人原发性肝癌血管内皮细胞的适宜方法。2利用免疫细胞化学检测FⅧ一Rag及透射电镜观察Weibel-Palade小体从而鉴定血管内皮细胞。3初步研究CD31、CD34、CD105在人原发性肝癌血管内皮细胞的表达。方法:标本及试剂:正常及肝癌组织取自第三军医大学西南医院肝胆外科手术切除新鲜标本。试剂从以下公司购得:标准胎牛血清,HEPES,碳酸氢钠,DMEM (高糖型)基础培养液,肝素钠,胰岛素,明胶,L-谷氨酸均为美国Sigma公司产品;内皮细胞生长添加物ECGS,碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)为Hyclone公司产品;磷酸盐溶液(PBS),抗菌素:青链霉素购自上海生物工程有限公司;35-mm的塑料培养皿,25 cm2和75 cm2的培养瓶购自北京中山生物公司;鼠抗人CD31,CD34,CD105单克隆抗体,兔抗人factorⅧ-related antigen (FⅧ-Rag)多克隆抗体,鼠抗人a-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体,FITC荧光标记山羊抗小鼠IgG也购自北京中山生物公司;EnVisio免疫组化试