论文部分内容阅读
植物表皮是研究植物生长发育、细胞分裂与分化、形态建成的理想模型,其研究成为近年来的热点。水稻作为最重要的粮食作物之一,更是单子叶植物的模式植物,对其表皮细胞及气孔发育的研究具有重要的理论意义和潜在农业应用价值。但是目前水稻中有关叶表皮发育的报道大多是基于形态学观察,有关调控发育过程的机制研究较少。本文主要阐述了 LPL2与DSP1基因参与水稻叶表皮细胞形态建成及探索其作用的分子机理。本论文分离到3个叶表皮细胞边缘突出变平滑的突变体,分别命名为lpl1-1(lesspronounced lobe epidermal cell 1-1)、lpl2-1和 lpl3-1,重点研究了lpl2-1。lpl2-1幼苗期植株高度变矮,根长变短、根细胞变短;成熟期植株矮化、稻穗变短,叶与茎表皮细胞边缘突出变平滑,乳突数目减少,气孔密度升高、并且部分气孔复合体出现畸形。lpl2-1对干旱以及盐胁迫敏感,适应逆境能力明显减弱。遗传分析表明lpl2-1是单基因隐性遗传,通过图位克隆技术克隆到突变基因为Os03g05020。该基因与拟南芥中PIR和玉米中BRK2基因有很高的同源性,水稻中我们命名为LPL2。在lpl2-1中,由于LPL2第16位外显子缺失26个碱基,导致第594位编码甘氨酸的密码子变成终止密码子,转录提前终止。lpl2-1与另外2个等位基因的T-DNA插入突变体lpl2-2,lpl2-3杂交,F1代表现出与亲本完全相同的表型,遗传证据表明lpl2-1突变基因就是LPL2;同时在lpl2-1中超表达LPL2,TO代完全恢复了突变表型;超表达LPL2转化中花11,TO代没有新表型,因此确定lpl2-1的突变表型是由LPL2功能缺失导致的。qRT-PCR分析表明,LPL2在植物各个器官中广泛表达;亚细胞定位实验表明,LPL2蛋白定位在在细胞质与细胞膜上;用鬼笔环肽AF-488标记微丝,发现lpl2-1微丝的分布发生变化,导致细胞骨架结构改变。LPL2与拟南芥中组成SCAR/WAVE复合体的PIR亚基也是同源蛋白,超表达LPL2转化拟南芥pir突变体,部分恢复了叶和茎表皮毛扭曲的表型。通过生物信息学分析,我们把水稻中与拟南芥和玉米中对应的同源基因HSPC300(BRK1)和NAPl(BRK3)分别命名为 LPL1(Os02g8320)和 LPL3(Os08g43130)。同源功能分析表明:LPL1、LPL2和LPL3可能是组成水稻SCAR/WAVE复合体的不同亚基。从RNAi-LPL1/ZH11后代中筛选到了lpl1-1突变体,同时订购了 T-DNA插入突变体lpl3-1,它们与lpl2-1表型相似,幼苗期植株都矮化,表皮细胞变平滑、边缘突出不明显,且lpl1-1刺毛尖端变短、变钝。酵母双杂交实验初步证明LPL2能分别与水稻中LPL1和LPL3相互作用,并且与上游OsROP2直接相互作用,据此推测LPL2参与水稻中 OsROPs-SCAR/WAVE-OsARP2/3 信号通路。另外,本论文筛选到气孔突变体dsp-1(disturbed stomatal pattern-l),叶气孔及茎气孔簇生、畸形,气孔密度降低;植株矮化;花结构异常,退化的副护颖变长,雄配子不育。利用hiTAIL-PCR技术将T-DNA插入位置定位在Os07g03730和Os07g03740两个基因之间。qRT-PCR分析,Os07g03730表达量升高200多倍,然而在中花11中超表达该目标基因不能模拟气孔簇生的表型,RNAi-DSPl/dsp-1也没有恢复表型。后续实验证明了dsp-1突变表型与T-DNA不连锁。通过图位克隆法克隆到了 DSP1候选基因,DSP1功能缺失导致气孔发育第一步和第二步不均等分裂异常,从而形成各种畸形气孔。