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研究背景：阿尔兹海默症(Alzheimer’s Disease,AD)是一种最为常见的中枢神经系统退行性疾病,为痴呆的最主要类型。目前“Aβ假说”被广泛地接受为AD最主要的发病机理,即老年斑的主要组成成分——β-淀粉样蛋白(amyloid-β,AB)是AD发病进程的中心机制,其在特定脑区内聚集,引发相应的神经毒性作用,造成突触损伤,神经元死亡,从而导致了AD患者记忆衰退和认知功能障碍等相应症状的产生。目前,AD的治疗研究策略主要包括三个方面：一是开发新的低毒性的拟胆碱药物；二是神经营养物质的应用,包括直接脑室灌注神经营养因子和神经营养因子基因修饰细胞的脑内移植治疗；三是干细胞的移植治疗。但这些疗法基本在于减慢神经元的退变或加速神经元的产生,并没有从根本上阻止AD患者的病变,其远期治疗前景不容乐观。而中医药临床表明,以石菖蒲为主的药方是治疗AD方剂的基本结构,位居单味药使用频次第1位,疗效肯定。但石菖蒲抗AD的药效部位及抗AD的“Aβ”机制尚未阐明,影响了石菖蒲抗AD疗效的进一步提高。我室前期工作证明,石菖蒲挥发油部位对AD模型小鼠学习记忆能力有明显提升作用,作用机制可能与其拮抗凋亡相关因子表达有关,提示挥发油部位有可能用于AD的防治。为进一步探讨石菖蒲挥发油部位抗AD及其发挥神经保护作用的有效成分,为石菖蒲抗AD及用于神经保护药物的研发提供科学依据,本实验首先用Aβ1-42寡聚体对体外培养的原代皮层神经元进行优化筛选,建立了Aβ1-42寡聚体致神经元损伤模型。在此模型上探讨β-细辛醚(β-asarone)、丁香酚(Eugenol)以及β-细辛醚联合丁香酚共孵育对Aβ1-42致神经元损伤模型的保护作用及机制,为石菖蒲抗AD及用于神经保护药物的研发提供科学依据。研究目的：1.观察β-细辛醚和丁香酚对正常状态下原代皮层神经元和PC12细胞的形态和细胞活力的影响,初步了解β-细辛醚和丁香酚的神经保护作用；2.观察p-细辛醚、丁香酚及p-细辛醚联合丁香酚共孵育对Aβ1-42寡聚体诱导的原代皮层神经元和PC12细胞损伤模型的保护作用,并探讨其作用机理。研究方法：实验一1.首先取胎鼠的皮层组织进行原代皮层神经元的培养,培养第六天进行免疫细胞化学染色鉴定神经元；2. Aβ1-42寡聚体诱导的皮层神经元损伤模型的建立,ELISA检测相关因子的释放水平；3.观察β-细辛醚和丁香酚对皮层神经元的细胞活力的影响；4.原代皮层神经元培养第六天加入Aβ1-42寡聚体建立细胞模型,24小时后再用β-细辛醚和丁香酚作用于细胞。三天后提取蛋白进行凋亡相关因子的检测；实验二1.石菖蒲主要有效成分β-细辛醚和丁香酚对正常状态下PC12细胞形态和细胞活力的影响；2.建立PC12细胞的Aβ1-42寡聚体诱导损伤模型；3.PC12细胞培养第六天加入Aβ1-42寡聚体建立细胞模型,24小时后再用p-细辛醚和丁香酚作用于细胞。三天后提取RNA进行凋亡相关基因的检测；4.通过Tunel法探讨p-细辛醚和丁香酚对Aβ1-42寡聚体诱导的PC12细胞的保护作用机理。研究结果：实验一1.培养至第六天的原代皮层神经元胞体的突起明显,免疫细胞化学染色显示,神经元标志物呈阳性；2.通过ELISA检测TNF-α的释放水平,建立起Aβ1-42寡聚体诱导的皮层神经元损伤模型；3.培养至第三天的皮层神经元分别与10-10-10-8Mp-细辛醚、丁香酚以及p-细辛醚联合丁香酚共孵育24h,与正常培养的神经元相比,10-6β-细辛醚和10-7M丁香酚组细胞存活率最高；4.Western blotting技术检测凋亡相关蛋白,显示Aβ1-42寡聚体作用于皮层神经元6h后,促凋亡蛋白Bax表达开始增加,至24h达到较高水平；与之相反,抗凋亡蛋白Bcl-2表达随Aβ1-42寡聚体作用时间延长逐渐降低；5.10-10-10-8Mp-细辛醚和丁香酚可明显拮抗Aβ1-42寡聚体引起的促凋亡蛋白Bax表达上调以及抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降。实验二1.培养至第三天的PC12细胞与10-10-10-8Mβ-细辛醚和丁香酚分别共孵育24h,与正常培养的PC12细胞相比,10-6β-细辛醚和10-7M丁香酚组细胞存活率最高；2.RT-PCR技术检测凋亡相关基因,显示Aβ1-42寡聚体作用于PC12细胞后,促凋亡蛋白Bax表达开始增加,抗凋亡蛋白Bcl-2表达逐渐降低；3.10-10-10-8Mp-细辛醚和丁香酚可明显拮抗Aβ1-42寡聚体引起的PC12细胞促凋亡基因Bax表达上调以及抗凋亡基因Bcl-2表达下降；4.TUNEL方法检测PC12细胞凋亡：β-细辛醚、丁香酚及其混合物的预孵育组,与Aβ1-42寡聚体对照组相比较,阳性细胞数量明显减少。p-细辛醚联合丁香酚用药组优于单体的单独作用组。结论：1.Aβ1-42寡聚体能显著抑制神经元的再生,这种毒性效应可能与其促进凋亡相关因子的表达有关。2.β-细辛醚和丁香酚能明显拮抗Aβ1-42寡聚体引发的神经元(PC12细胞)细胞凋亡,这可能与其能抑制凋亡相关因子的表达有关。3.对于Aβ1-42寡聚体诱导的原代皮层神经元和PC12细胞损伤模型的保护作用,β-细辛醚联合丁香酚组明显优于单体的单独作用组。这为石菖蒲用于抗老年性痴呆药物的研发提供了科学的依据。