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目的:通过体内和体外两种模型,评价金线莲水提物(Water Extract of Anoectochilus roxburghii,WEAR)及主要成分金线莲苷(Kinsenoside,Kd)对免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,AIH)的治疗作用,并进一步探讨其作用机制。 方法:(1)体外诱导脾细胞实验:分离培养小鼠原代脾细胞,加入5μg/mLConA溶液诱导其增殖分裂,1h后分别给予WEAR(320*、320、160、l80、40、20、10、5μg/mL)和Kd(32*、32、16、8、4、2、1、0.5μg/mL)继续培养24h,测定细胞上清液TNF-α,IFN-γ和IL-4的含量。其中320*μg/mL和32*μg/mL组以分别考察WEAR和Kd自身对细胞的影响。阳性对照选择水飞蓟素(Silymarin)50μg/mL。 (2)体内ConA诱导小鼠自身免疫性肝炎实验:健康雄性Balb/c小鼠随机分为12组,每组10只,连续给药一周,WEAR口服给予40,20,10mg/10g(b.w.)三个剂量,Kd口服给予10,5,2.5mg/10g(b.w.)三个剂量。阴性对照分别为两种药物高剂量,以排除药物本身可能造成的阳性结果。阳性药为地塞米松(Dexamethasone,DEXA)0.009mg/10g和水飞蓟素(Silymarin)0.5mg/10g,正常组和模型组给予等量的蒸馏水。末次给药1h后尾静脉注射0.2mg/10g的ConA溶液,并于6h、24h分批处死小鼠。检测小鼠血浆肝功能水平(AST和ALT)、苏木精伊红染色(HE)切片观察组织病理学变化、酶联免疫吸附法(ELISA)测定血浆中TNF-α,IFN-γ,IL-4,IL-6以及IL-10的水平;TUNEL法测定肝细胞凋亡指数;免疫组化法测定肝内CD4+T和CD8+T细胞的浸润,综合评价WEAR和Kd的保肝效果。 结果:(1)体外脾细胞培养结果显示,WEAR(80~320μg/mL)和Kd(8~32μg/mL)可呈现剂量依赖性的降低细胞悬液中TNF-α,IFN-γ和IL-4的含量,其中WEAR(320μg/mL、160μg/mL)和Kd(32μg/mL)作用最为明显(P<0.05)。 (2)体内实验采用尾静脉注射 ConA24h后测定血浆转氨酶时发现,WEAR和Kd的高、中剂量可显著的降低血浆转氨酶(P<0.05),且高剂量的WEAR与地塞米松的治疗效果相当;ELISA测定血浆中细胞因子TNF-α,IFN-γ,IL-4,IL-6以及IL-10含量时发现,模型组各细胞因子均显著性升高,而给药组能降低各炎症因子的含量,尤其以WEAR高、中剂量和Kd高剂量尤为显著。肝脏HE切片显示,WEAR和Kd能减少炎症因子的浸润和增强对肝实质的保护;TUNEL切片也能看出,WEAR和Kd可明显抑制肝细胞的凋亡;从CD4+T和CD8+T细胞的免疫组化分析,WEAR和Kd可剂量依赖性的降低肝内淋巴细胞的浸润。 结论:(1)体外WEAR和Kd可通过抑制脾细胞对炎症因子的释放,发挥免疫调节效应。 (2)体内WEAR和Kd对ConA诱导小鼠免疫性肝炎模型具有较好的治疗作用,可明显减少肝脏炎症因子和淋巴细胞的浸润,保护肝实质,显示出较好的保肝活性。 以上结果提示金线莲和Kd可能作为保肝的潜在药物。