随着人们生活状况的改善和水平的提高,在肿瘤和心血管疾病之外,糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)作为人类健康的第三大威胁,被认为是当今社会一个严重的公共卫生问题。统计学研究表明患者一生之中有接近1/4的机率发生缺血性溃疡以及下肢动静脉疾病引起的慢性难愈合创面。然而其具体的发病机制还不是十分的清楚,有研究认为血管内皮细胞受损是糖尿病溃疡血管病变的始动环节,长期高糖环境下导致细胞功能紊乱,是其伤口难以愈合的重要原因。干细胞-生物材料治疗被认为是糖尿病溃疡治疗的发展趋势,间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell,MSC)由于其免疫豁免和多向分化的能力而被广泛的应用于糖尿病溃疡的治疗。然而溃疡表面的高血糖的微环境却严重损害了移植的干细胞的功能,最终引起移植效果不理想,因此控制溃疡治疗局部的血糖浓度对于糖尿病溃疡的治疗十分关键。罗格列酮是一种已经应用于临床的降血糖药物,具有控制血糖和改善胰岛素抵抗的作用,此外还能作用于间质干细胞,促进其进一步的分化。这些结果均说明罗格列酮可能会通过影响间充质干细胞的功能,进一步促进糖尿病溃疡的愈合,而目前尚无文献报道罗格列酮在高糖环境下对间充质干细胞的影响。基于这个理论,我们在课题组前期研究的可降解的和高生物相容性的生物材料的基础上,将罗格列酮处理的间质干细胞种植于生物材料上,探讨其对促进小鼠糖尿病足溃疡愈合的效果,为临床上进一步的研究奠定基础。实验方法1.细胞培养与实验分组①对照组:配置好的α-MEM基础培养基、10%胎牛血清和5.6mM葡萄糖;②高糖组:配置好的α-MEM基础培养基、10%胎牛血清和25mM葡萄糖;③罗格列酮组:配置好的α-MEM基础培养基、10%胎牛血清、25mM葡萄糖和10u M罗格列酮;④AKT抑制组:配置好的α-MEM基础培养基、10%胎牛血清、25mM葡萄糖、10uM罗格列酮和5uM triciribine。2.间充质干细胞和人脐静脉内皮细胞增殖实验按照实验分组加入相应因子刺激后,利用MTT法,将间充质干细胞和内皮细胞制成细胞悬液,使用计数板调节细胞浓度后加至96孔板中,按分组给予药物或稀释培养基刺激作用24小时后依次加入mtt孵育4小时,去掉培养基加入dmso并检测吸光值,观察间充质干细胞和内皮细胞的增殖情况。3.内皮细胞划痕实验将生长至对数期的内皮细胞种植于6孔板中,待其单层铺满6孔板孔底,将0.1%fbs的正常培养基作用于对照组,其他3组都使用0.1%fbs高糖培养基,37℃,5%co2孵育24小时。然后以无菌p1000枪头垂直进行细胞划痕,洗去划下的细胞。按照已分的四组分别给予药物或1:5稀释的条件培养基刺激,常规培养24小时。0.01mpbs晃洗后,4%多聚甲醛固定20min,0.5%结晶紫染色。镜下拍摄图片,使用ipp软件(mediacybernetics)测量内皮细胞创痕面积。4.细胞transwell小室实验使用生长至对数期的msc或huvec制成细胞悬液,取1x104细胞个数种于25mm8.0μm的transwell细胞小室上室内,下室按分组给予药物或条件培养基,常规孵育6小时,将小室从培养箱中取出,使用棉签将小室内底面间充质干细胞或内皮细胞擦去。4%多聚甲醛固定20min,0.5%结晶紫染色,计算迁移至小室滤膜下方msc或huvec的阳性细胞数量。5.elisa试剂盒对条件培养基按说明书进行相应检测,观察其细胞因子的含量变化。6.将间充质干细胞接种于制备好的生物材料上,进行常规培养,观察其生长情况。7.建立模型以及创面处理采用链脲佐菌素(stz)腹腔连续5天注射,空腹血糖>16.7mmol/l为糖尿病小鼠。结扎股动脉近端,使下肢缺血,在大腿背侧皮肤造成直径5mm全层创面,以此建立糖尿病足溃疡模型。按照分组情况用含2x104个数的间充质干细胞或药物刺激后的msc生物组织材料覆盖于伤口区,统计创面愈合的大小。8.组织切片免疫荧光和苏木精-伊红染色将切片于37℃过夜烤干,取出后山羊血清封闭30min,加入一抗cd31孵育1小时,pbs洗3次后加入二抗罗丹明标记的羊抗兔igg孵育1小时,洗片后使用抗荧光淬灭封片剂封片,显微镜下观察。组织冰冻切片37℃烤干,酒精下行浓度依次脱水2min/次,蒸馏水中晃洗后,苏木精染色2min,蓝化后,盐酸酒精分色10s,伊红染液染色1min,酒精上行浓度依次脱水,二甲苯透明,使用中性树脂封片,镜下观察细胞融合和血管新生情况。实验结果1.经罗格列酮药物处理后的间充质干细胞和内皮细胞增殖和迁移能力明显的高于高糖组(P<0.05)。且条件培养基中VEGF和SDF-1的含量相较于高糖组有显著地升高(P<0.05)。AKT阻断剂可以阻断罗格列酮对间充质干细胞以及内皮细胞增殖、迁移和分泌功能的促进作用。2.间充质干细胞能够在生物材料上正常生长、增殖。罗格列酮组的细胞数量相较于对照组和AKT抑制组明显增加(P<0.05),动物手术后按规定天数测量伤口面积大小,RSG-MSC治疗组相较于MSC对照组,创面愈合速度明显增快,治疗效果具有显著差异(P<0.01),组织形态学观察RSG-MSC组血管密度与MSC组比较之下明显增高,MSC(GFP转染,自发绿色荧光)与罗丹明标记发红色荧光CD31因子的血管内皮细胞相互融合的情况明显多于MSC对照组。结论罗格列酮对高糖环境下的间质干细胞以及MSC条件培养基对内皮细胞,能够显著促进其增殖、迁移和分泌功能,在这个过程中AKT信号通路发挥着重要作用。罗格列酮作用的MSC生物材料能较好的促进糖尿病足创面的愈合。