基因VIk亚型PPMV-1分离鉴定及致病性分析

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鸽新城疫(Newcastle disease,ND)是近年来可引起鸽严重发病死亡的病毒性传染病,是危害养鸽业的重要传染病之一,其病原为鸽Ⅰ型副黏病毒(Pigen Paramyxovirus typeⅠ,PPMV-1),属于基因Ⅵ型新城疫病毒,又称鸽新城疫病毒。PPMV-1的进化速率较快,目前该毒株的传播并未持续扩大,而是维持一定种群内部的不断演变。因此对广东省鸽场的鸽新城疫病毒的传播进行监测,了解当前PPMV-1的传播情况与毒力强弱十分必要。并且,目前市场上新城疫疫苗均为La Sota疫苗和基因Ⅶ型疫苗,无基因Ⅵ的专属疫苗。因此,这些疫苗对防疫鸽PPMV-1的作用效果有待研究。本课题组于2016年12月至2017年6月对广东省鸽场进行流行病学监测,期间使用血凝抑制试验(HI)对350份鸽场送检血清进行抗原检测,发现广东省大多数鸽场的鸽体内新城疫抗体水平均较低。有意义的是,由于鸽场免疫时主要使用La Sota疫苗或基因VII型疫苗,并无针对NDV基因VI型的特异性疫苗,所以在进行HI检测时发现,使用不同基因型的病毒作抗原时,测得的抗体水平有很大差异,用基因VI型毒株作为抗原时,测得的抗体水平偏低,这也再次证明了鸽场使用的疫苗对感染基因VI型毒株的鸽保护程度会偏低。流行病学调查期间本课题组在增城某鸽场送检的病死鸽体内分出两株鸽新城疫(PPMV-1)强毒株,命名为PPMV-1/Guangdong/B5/2017和PPMV-1/Guangdong/SZ/2018,而后进行3次蚀斑纯化,对纯化后的毒株进行全基因序列和种群动态分析。F基因的遗传进化树分析表明,该毒株属于NDV的class II的基因VI型。本实验研究主要针对B5毒株,为了解B5毒株的生物学特性,对该毒株B5进行鸽致病性试验研究,用它感染3组不同日龄的鸽,分别为3周龄、6周龄和12周龄。感染剂量为106 EID50,在感染第3 d和第7 d时,每组剖杀3只,检测病毒在鸽体内的复制情况。感染第3 d时肾脏、脾脏、肺脏含毒量最高,感染第7 d时脑、肾脏、脾脏和腺胃的含毒量有上升,说明病毒已突破血脑屏障,此时神经症状也更为明显,感染鸽有明显的腿部无力,倒地不起伴随脚部向上抽搐震颤、扭头等症状。3周龄鸽感染组最先发病死亡率100%,同居对照组死亡率也为100%;6周龄鸽感染组死亡率100%,同居对照组死亡率为66%;12周龄鸽较慢产生临床症状及死亡现象,感染组死亡率为83.3%,同居对照组死亡率为0%。结果表明,B5毒株为一株导致鸽高致病率和高死亡率的强毒株。为了检测当前新城疫疫苗对B5的保护性,设计了3种疫苗对感染PPMV-1鸽的保护性试验。采用3周龄鸽分别免疫La Sota弱毒苗、La Sota灭活苗和基因Ⅶ型灭活苗,免疫后第21 d采血,测所有鸽对PPMV-1的抗体水平。HI结果显示,所有免疫组鸽的抗体水平均为阳性,但平均抗体水平并不高,免疫第22 d时,感染试验组,感染量为106 EID50。对照组鸽在感染12 d全部死亡,NDV基因Ⅶ型苗免疫组的死亡率达到60%,La Sota弱毒苗免疫组的死亡率达到30%,La Sota灭活苗保护率较好,但也未达到完全保护,死亡率为10%。在感染期间,发病鸽呈现倒地不起,翅膀下垂,脚部蜷缩震颤,双腿无力等明显发病症状,与PPMV-1对鸽的致病性试验结果一致。结果表明3种疫苗对B5均不能完全保护。并且为了评价PPMV-1的免疫原性和生物学特性是否发生变异或相互之间的关联性,对PPMV-1的抗原性变异系数进行了差易分析,不同毒株间抗原分型和抗原差异性大小评价的依据称为R值,PPMV-1与La Sota之间的R值为0.597,PPMV-1与m GM之间的R值为0.672,结果表明PPMV-1与La Sota和m GM为不同亚型。综上所述,广东省某鸽场分离B5毒株可导致不同日龄鸽发病死亡,为一株强毒株,虽然其发病程度随年龄变化可减轻,但12周龄鸽也可产生大量死亡,并且大多数鸽场饲养的鸽基本为3周龄左右,6周龄以上的较少,因此可得出广东省鸽场已面临强毒株PPMV-1的威胁。但目前新城疫疫苗却不能对鸽产生较好的保护性,3种疫苗的保护效果均不能达到100%,其中NDV基因Ⅶ型苗保护效果最差,其次为La Sota弱毒苗,La Sota灭活苗保护效果较其他两组好一些。因此,针对新城疫基因Ⅵ型的疫苗的研发必不可少,只有基因Ⅵ疫苗的尽快上市,才能减少PPMV-1对公共卫生安全和对鸽场的巨大威胁。
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