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由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引起的2019冠状病毒病（Coronavirus Disease 2019,COVID-19）自2019年末起已在全球范围内流行。截至2022年3月2日,COVID-19已造成了超过4.5亿人感染,602.9万人死亡,严重危害了全球人民的生命财产安全。因此,阐明SARS-CoV-2的感染、复制及致病机制,并据此开发抗病毒药物意义重大。Caspase家族作为半胱氨酸蛋白酶,能够特定的生理或病理条件下选择性切割目的蛋白,诱导细胞凋亡的发生。本研究首先发现含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase）的广谱抑制剂Z-VAD-FMK能显著抑制SARS-CoV-2的复制,提示Caspase可能参与病毒复制的调节。在过表达新型冠状病毒受体血管紧张素转化酶2（ACE2）的HeLa细胞（HeLa-ACE2）中利用小干扰RNA（siRNA）对8种常见Caspase进行敲低实验发现,Caspase-2或Caspase-8的敲低能抑制SARS-CoV-2复制,而Caspase-1,3,4,9的敲低则无显著效果。鉴于Caspase-2具有比Caspase-8更强的功能,本研究选择Caspase-2为主要研究对象。过表达实验表明,Caspase-2的上调能够促进SARS-CoV-2的复制水平,结合上述敲低结果,本研究显示Caspase-2参与调控SARS-CoV-2的复制。迄今为止,Caspase-2在细胞凋亡中的功能尚未被完全阐明,曾被认为是一类“孤儿”Caspase。为进一步探究Caspase-2的活性在调控病毒复制中的作用,我们构建了包括酶活性位点突变等一系列Caspase-2突变质粒,并分析了这些Caspase-2突变体对病毒复制的影响。结果表明,过表达野生型及核定位序列突变的Caspase-2能促进SARS-CoV-2复制,而酶活性位点突变体及Caspase募集结构域缺失突变体不能有效促进病毒复制,表明Caspase-2的酶活性对于调控SARS-CoV-2复制较为关键。近年来有研究表明,Caspase-2具有通过抑制活性氧（ROS）的产生来抑制细胞自噬的能力。鉴于自噬参与冠状病毒的复制,本研究进一步探究了 Caspase-2对自噬的抑制功能是否与其调控病毒复制的功能相关。研究发现,在敲低了Caspase-2的HeLa-ACE2细胞中,自噬标记物LC3B由胞浆型（LC3B-I）转换为了膜型（LC3B-Ⅱ）,且胃蛋白酶及溶酶体蛋白酶抑制剂实验提示Caspase-2缺失后自噬通量增加,表明敲低Caspase-2介导了完全自噬的发生。进一步分析表明,在Caspase-2敲低的细胞中,病毒核衣壳（nucleoprotein）蛋白的表达与LC3B-Ⅱ的转化成反比,提示Caspase-2可能通过自噬途径调控病毒复制。因此,本研究分析了自噬抑制剂渥曼青霉素（Wortmannin）以及促进活性氧产生的线粒体质子载体解偶联剂（CCCP）对病毒复制的影响,结果发现两种药物的处理均不足以使病毒复制发生类似敲低Caspase-2后的显著改变,提示Caspase-2可能通过自噬及活性氧非依赖性方式调控SARS-CoV-2的复制,其机制有待深入研究。随着COVID-19在世界范围内的流行,出现了越来越多传播力、致病力和免疫逃逸能力增强的SARS-CoV-2突变株,给临床治疗药物和疫苗的研发带来了巨大挑战。为了迅速找到具有广谱抗病毒活性的化合物,本研究还开展了基于药物再利用（drugrepurposing）的筛选工作。首先,由于病毒入侵是病毒进行感染复制的关键步骤,也是抗病毒研究的重要靶点,本研究通过假病毒系统对实验室前期报道的20种已被美国食品药品监督管理局（FDA）批准的,并且具有抑制SARS-CoV-2复制活性的化合物进行了二次筛选,并同时检测了药物对细胞活性的影响,初步确定了 6种能安全有效抑制SARS-CoV-2原型株（WH01）假病毒侵染的化合物。本研究进一步验证了这些化合物对重要突变株B.1.617.2（Delta）及B.1.1.529（Omicron）假病毒侵染的影响,结果发现吩塞嗪类化合物盐酸三氟拉嗪和盐酸硫利达嗪对这两种突变株假病毒均具有良好的抑制作用。最终,通过在生物安全3级实验室进行的活病毒感染实验,发现这两类化合物能高效抑制WH01、Delta及Omicron病毒的侵染,提示其可能具有广谱抗SARS-CoV-2的功能。综上所述,本研究通过对Caspase家族蛋白的功能性筛选,初步发现并验证了 Caspase-2对新冠病毒复制的调控,并进一步发现Caspase-2酶活性对于调控病毒复制较为关键。另外,本研究利用基于SARS-CoV-2及其突变体假病毒的药物筛选,结合活病毒感染验证,成功鉴定了两种高效抑制SARS-CoV-2 WH01、Delta及Omicron株侵染的FDA批准的化合物盐酸三氟拉嗪（Trifluoperazine 2HCl）和盐酸硫利达嗪（Thioridazine HCl）。总之,这些研究对于深入理解SARS-CoV-2与宿主相互作用的机制提供了线索,并为发展新型广谱抗SARS-CoV-2感染药物提供了思路。