目的:羧甲基纤维素(carboxymethylcellulose,CMC)是一种高分子粘性多糖,是人工眼泪的主要组分,能延长药物在眼球表面的停留时间。研究表明CMC可以明显改善干眼症患者的临床症状,并且其效果呈剂量依赖性。通常认为CMC可以延长药物在眼球表面的停留时间是由其物理特性决定的,目前尚不知CMC是否可以直接作用于眼球表面,特别是上皮细胞,从而影响角膜上皮损伤的修复。有报道认为CMC可以减低LASIK术后眼球上皮损伤的发生率,也有人报道配戴隐形眼镜前滴加CMC滴眼液具有细胞保护作用,减轻角膜和结膜充血,并且使眼部感到更为舒适。尽管CMC发挥这些保护作用的确切机制尚不清楚,但这些研究提示CMC可能参与眼球表面上皮损伤的修复过程。　　 本研究将采用体外划伤愈合分析(scratch-wound closure assay)和动物模型观察CMC对角膜上皮损伤修复的影响,并探讨其可能的机制。　　 方法:　　 1、细胞培养:将复苏传代的人角膜边缘上皮细胞(humancornea-limbal epithelial,HCLE)用K-SFM培养基培养至满汇合备用。　　 2、体外划伤愈合分析:将HCLE细胞接种于预先用胶原Ⅰ包被的8孔腔式培养玻片上,制备体外细胞划伤愈合分析模型。利用图像分析软件系统在不同位置测量划伤的平均宽度,计算划伤愈合的百分率并进行组间比较。　　 3、细胞增殖实验:将HCLE细胞按每孔1×104个细胞接种于黑色96孔培养板上,孵育24小时后,加入含有不同浓度(0,0.02,0.2,2mg/ml)CMC的1:1混合培养基(K-SFM和低钙的DMEM/F12),分别继续培养0、8、24和48小时。室温下放置2-5分钟,摇匀测定每孔的荧光强度(波长485/535 nm),荧光强度的数值与每孔活细胞数成正比。　　 4、细胞迁移分析:将HCLE细胞接种于硅化处理的胶筒内,加入K-SFM培养基,置培养箱内培养至单层满汇合时,加入100μM羟基脲(hydroxyurea)继续培养24 h,以阻止细胞增殖。去掉胶筒,用K-SFM培养基洗涤细胞三次,再加入含有和不含有CMC的培养基继续培养24h。培养结束后用Diff-Quik试剂对细胞进行固定并染色,显微镜下观察细胞迁移情况并拍照。　　 5、细胞趋化分析:将HCLE细胞接种于上层腔式培养板内,然后置于下层腔式培养板内,加入含有或不含有CMC的K-SFM培养基,同时加入含有2 mg/mL透明质酸钠(HA)的K-SFM培养基作为阳性对照,置培养箱内培养12 h。迁移至膜底的细胞用消化液溶脱掉,然后用裂解缓冲液裂解细胞,加入荧光染料与细胞的核酸结合,用分光光度计测定荧光强度(波长485/535 nm),荧光强度反映迁移的细胞数。　　 6、细胞粘附试验:将HCLE细胞悬液接种于预先用纤维连接蛋白(5μg/cm2)、Ⅰ型胶原蛋白(10μg/cm2)和BSA(1％)包被并加入含有或不含有CMC的96孔板内培养4 h。每孔加入10μ L WST-1试剂,孵育2 h,用酶标仪(450 nm的波长)测定每孔的吸光度,粘附细胞的数目与吸光度成正比。　　 7、动物实验:新西兰大白兔12只,在手术造模前2周除去双眼瞬膜,随机分为实验组和对照组,每组各6只。在2组白兔的右眼角膜中央,制成直径6.0 mm的角膜损伤模型。对照组滴加PBS液,实验组滴加含1％CMC的PBS液,每日给药四次。分别于给药前和给药后24 h采用角膜荧光素染色的方法观察创伤愈合情况。利用计算机图像分析系统(Image J1.33)计算角膜上皮修复面积。　　 8、统计学处理:所有结果均以均值±标准差((x)±s)表示。应用SPSS13.0软件进行单因素方差分析(One-way analysis of varialice,ANOVA)及两两比较,以P<0.01为差异有统计学意义。　　 结果:　　 1.CMC对HCLE细胞划伤愈合的影响:CMC处理组损伤的愈合百分比远远大于仅用培养基处理的溶剂对照组(P=0.00952),提示CMC具有促进角膜上皮细胞损伤愈合的作用。　　 2.CMC对HCLE细胞增殖的影响:细胞增殖实验结果显示,低浓度CMC对HCLE细胞的增殖无明显影响,与溶剂对照组比较无显著的统计学差异(P>0.01)。然而,用高浓度的CMC分别处理HCLE细胞24和48小时后,细胞的增殖能力明显受到抑制(P=0.008和P=0.004)。但相差显微镜观察结果显示,其细胞形态与对照组一致,表明CMC没有明显细胞毒性效应。　　 3.CMC对HCLE细胞迁移的影响:细胞迁移分析结果显示,与未加CMC的溶剂对照组相比,CMC可以明显促进HCLE细胞向四周的迁移,而对照组未观察到细胞迁移现象。　　 4.CMC对HCLE细胞趋化的影响:细胞趋化实验结果显示,CMC对HCLE细胞具有趋化作用,且呈浓度依赖性,高浓度CMC诱导的迁移细胞数的增加是低浓度CMC的1.5倍。同时,在下层培养板中加入2.0mg/mL透明质酸(hyaluronic acid,HA)作为阳性对照,表明所用细胞株具有迁移能力。　　 5.CMC与细胞外基质蛋白结合从而促进HCLE细胞的粘附:细胞粘附实验的结果显示,将细胞外基质蛋白与CMC共同预孵育,可显著增加粘附于胶原和纤维连接蛋白的细胞数量。而将BSA与CMC的共孵育则不影响HCLE细胞粘附的数量。　　 6.CMC促进损伤后兔角膜上皮的再生:动物实验结果表明,兔角膜上皮损伤后24小时,CMC治疗组的损伤面积小于PBS处理的对照组；CMC治疗组角膜缺损减少的平均百分率高于PBS处理的对照组。t检验结果显示,在分别用CMC和PBS处理24小时后,两组之间有明显的统计学差异(P<0.001)。　　 结论:　　 1、CMC具有一定的生物学功能,体外可刺激单层HCLE细胞划伤的愈合,在体内可促进兔角膜上皮损伤后的修复过程。　　 2、低浓度CMC对细胞增殖没有影响,高浓度CMC表现出一定的抑制细胞增殖的作用。　　 3、CMC对HCLE细胞的迁移具有较强的促进作用。这种促进作用一方面表现在CMC直接与细胞外基质结合,从而促进静止期HCLE细胞的迁移；另一方面,CMC可作为化学趋化物质促进了HCLE细胞的迁移。　　 4、CMC可以与纤维连接蛋白或者胶原等基质蛋白结合,形成CMC-纤维连接蛋白/胶原复合物从而促进上皮细胞粘附,CMC促进角膜上皮损伤的愈合可能也是通过与细胞外基质蛋白的结合而发挥作用的。