现代社会，随着人口老龄化的不断增加及生活、工作压力的不断加大，越来越多的人出现腰腿痛的症状，且具有年轻化的趋势，研究表明腰椎间盘退行性疾病（degenerative disc disease，DDD）是引起腰腿痛的主要病因之一。DDD不仅严重影响了患者的生活质量，而且给患者家庭及社会带来了巨大的医疗经济负担。目前多数学者认为椎间盘的退变源于髓核，髓核细胞凋亡、功能下降，功能性细胞外基质合成减少。目前常规的治疗方式都不能从根本上延缓或修复椎间盘的退变，远期治疗效果也不理想。近年来随着现代医学的发展以及组织工程学技术的进步，生物学治疗技术成为各领域研究的焦点，其中利用种子细胞移植或组织工程髓核的方法来修复已退变的椎间盘成为新的探索热点。种子细胞移植治疗及细胞活性研究是生物学治疗方法研究的基础；组织工程髓核技术研究的首要问题、基本问题同样是筛选一种最为合适的种子细胞，然后再联合应用生物支架材料、细胞因子等等。截至目前，已研究的种子细胞有很多种，其中脂肪干细胞（adiposederived stem cells，ADSCs）由于具有取材方便、对机体的创伤小、增殖能力强等诸多优点，已经广泛应用于多种组织的再生研究，包括椎间盘退变的修复研究。很多实验也证实ADSCs的移植可以延缓椎间盘的退变，ADSCs与髓核细胞共培养可诱导ADSCs分化为类髓核细胞，其原理可能就是通过髓核细胞分泌的多种生长因子如转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）等对ADSCs起作用的。目前采用Beagle犬ADSCs在椎间盘退变修复研究中的应用较少，体外联合应用两种细胞生长因子诱导ADSCs分化为类髓核细胞的报道尚少见。基于以往种子细胞移植及组织工程髓核方面的各项研究基础，我们将选取Beagle犬ADSCs作为种子细胞研究对象，联合使用TGF-β1、骨形态发生蛋白7（bone morphogenetic protein7，BMP-7）两种生物活性因子作为诱导环境因素，将细胞接种至该诱导环境中进行培养，研究该诱导液对ADSCs增殖情况的影响，探讨Beagle犬ADSCs向类髓核细胞分化的情况，对ADSCs作为种子细胞移植治疗椎间盘退行性疾病的探索和研究提供实验依据，为髓核组织工程体内外实验研究奠定基础。目的：观察体外分离、培养的Beagle犬ADSCs，流式细胞仪检测细胞免疫表型；研究含有TGF-β1、BMP-7的诱导液对ADSCs增殖及其形态情况的影响，探讨联合应用TGFβ-1、BMP-7两种生长因子能否诱导ADSCs向类髓核细胞分化，证实ADSCs可作为种子细胞，为椎间盘退变的细胞移植治疗及组织工程髓核研究提供理论依据。方法：无菌手术切取Beagle犬腹股沟处脂肪组织，采用I型胶原酶消化法与细胞贴壁法提取、分离、培养ADSCs，待细胞融合至80%时进行传代培养，倒置相差显微镜下观察细胞形态特征及生长状态；细胞计数法测定第3代ADSCs增殖能力，绘制细胞生长曲线。流式细胞仪检测第3代细胞表面抗原：CD34、CD45、CD73、CD105、HLA-DR、HLA-ABC。取生物学性能稳定细胞进行体外单层诱导培养，以细胞密度为1×105/ml接种至普通6孔培养板，分实验组及对照组，实验组用含有TGF-β1和BMP-7培养液进行诱导培养，对照组采用普通培养液进行培养，同时倒置显微镜观察细胞形态；采用CCK-8法对两组细胞的增殖能力进行检测比较；在培养后的第7、14天，提取细胞总RNA，进行反转录获得cDNA，利用Real Time-PCR法检测两组细胞I型胶原、II型胶原、蛋白多糖的基因相对表达情况。结果：原代细胞培养第2-3天可见部分细胞贴壁生长，细胞形态为椭圆形或短梭形，第6-7天观察细胞开始形成集落，呈典型的长梭形，第10天细胞呈漩涡状生长，细胞融合率80%左右。第3代ADSCs生长曲线呈“S”型，第1-3天细胞增殖速度较慢，第4-7天细胞呈对数增殖，第8天后细胞铺满平底，生长开始进入平台期。流式细胞分析检测细胞免疫表型结果：ADSCs表达CD73、CD105、HLA-ABC阳性，表达CD34、CD45、HLA-DR阴性。诱导培养7天后，倒置相差显微镜观察见细胞形态开始变为短梭形、多角形；CCK-8法检测结果提示在诱导微环境中培养的细胞增殖速度略低于普通培养基中培养的细胞的增殖速度。Real Time-PCR检测结果显示，在体外诱导培养第7天，实验组细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖基因的相对表达量明显高于对照组（P<0.05），差异具有统计学意义；然而I型胶原基因的相对表达量，两组之间无明显差别（P＞0.05），无统计学差异；体外诱导培养14天，实验组细胞II型胶原基因的相对表达量仍高于对照组（P<0.05），但低于诱导培养7天时，此时I型胶原、蛋白多糖基因的相对表达量无统计学差异。结论：通过I型胶原酶消化法和细胞贴壁分离法能够成功从Beagle犬腹股沟处脂肪组织中提取分离出ADSCs，其增殖能力强，生物学性能稳定；流式细胞仪分析检测细胞免疫表型提示细胞表达间充质干细胞的免疫表型，不表达造血干细胞免疫表型。含有TGF-β1、BMP-7的诱导培养液对ADSCs的增殖有一定的抑制作用，细胞形态也有所改变。联合应用TGF-β1、BMP-7两种细胞因子可诱导Beagle犬ADSCs向类髓核细胞分化。ADSCs有望成为良好的种子细胞来源用于椎间盘退行性疾病的生物学治疗，为椎间盘退变的细胞移植治疗及组织工程髓核研究奠定基础。