二型糖尿病患者在致死或者非致死的大血管事件中都具有很高的危险,包括冠状动脉粥样硬化或者脂肪沉淀性的血管粥样硬化。在患有二型糖尿的病人中,动脉粥样硬化是主要的致死因素[14]。大血管的动脉粥样硬化常常伴随着糖尿病的发展,而且这两种疾病有很多相同的致病因素,包括遗传和环境等因素[15]。在临床实践中,噻唑烷二酮类药物以及吡格列酮被广泛用于治疗二型糖尿病的患者,它可显著降低心血管事件发生的风险[16]。吡格列酮作为一种过氧化物酶增值受体γ激动剂,不仅能够降低血糖、抑制胰岛素抵抗及逆转二型糖尿病,同时还可以降低血压,升高高密度脂蛋白和脂联素浓度,并且广泛地降低体内外的血浆炎性标志物的水平[17-20]。然而,吡格列酮表现出抗动脉粥样硬化作用的内在机制仍然不清楚。因此,更好的理解吡格列酮抗动脉粥样硬化的机制,不仅能提供一个多向性的洞察角度,而且对心血管疾病的治疗提供一个新的目标。单核细胞和巨噬细胞聚集在损伤的内皮细胞壁下,促使动脉粥样硬化的发展从而形成粥样斑块,这就表示我们发现了一些治疗动脉粥样硬化的潜在的目标[21]。粥样硬化形成的病理生理过程,特别是粥样硬化损伤中吞噬细胞的趋化性主要受控于趋化因子[22]。在近40个人类趋化因子中,大多数都是导致动脉粥样硬化的[13]。在脂肪沉滞性动脉硬化症中,对于基质细胞源性因子-1(SDF-1)是否是促进粥样硬化还是抗动脉粥样硬化的报道出现分歧[13,23,24]。直到CXCR7出现前,CXCR4一直被认为是SDF-1的唯一特定受体[25]。是否CXCR7扮演一个信号或者非信号“诱饵”受体仍存在争议[26]。一方面,一些研究显示CXCR7是一种诱饵受体,它的功能类似一种清洗剂,清除细胞外的SDF-1或者通过与CXCR4异源二聚化来调控CXCR4的信号通路转导[26-28]。另一方面,CXCR7被证明可以触发SDF-1从而调控癌细胞或者神经元细胞的迁移[26,29,30]。当单核细胞向巨噬细胞分化的过程中,CXCR4下调导致CXCR7被诱导出[31]。此外,CXCR7是主要负责SDF-1和I-TAC刺激促炎症信号传导通路,增强巨噬细胞吞噬作用,从而可能造成了动脉粥样硬化[32]。而且,在单核细胞到巨噬细胞分化期间,CXCR7受体的上调是特异性的巨噬细胞趋化性的应答[31]。PPARγ激动剂,包括吡格列酮和罗格列酮,降低了促炎症巨噬细胞中趋化因子的表达,包括CCR1、CCR2、CCR3、CCR5和CX3CR1[33,34]。基于以上发现,我们非常有兴趣去探索吡格列酮对于巨噬细胞CXCR7的表达以及功能的潜在影响。实验方法:1.病人:从2012年5月到2013年9月,我院共采集连续24名住院患者资料,这些患者均患有二型糖尿病并符合颈动脉粥样硬化斑块剥脱术的手术指征。24名病人被随机分为吡格列酮治疗组和非噻唑烷二酮类药物治疗组。通过手术去除颈动脉粥样硬化斑块。于术前24小时采集血液标本,1500g 15分钟高速离心。分离出血清,保存在-80°冰箱中待检测。血清中吡格列酮的含量通过使用高效液相色谱法进行分析。这项研究通过吉林大学第二医院伦理学委员会的批准,并和每一位参与的病人签署知情同意书。这项研究完全符合赫尔辛基宣言及其他生物伦理原则。2.细胞准备、培养和刺激:使用聚蔗糖-泛影葡胺并采用密度梯度离心的方法分离出外周血里的单核细胞。该实验符合赫尔辛基宣言中对于使用人体组织进行实验之规定,并且获得吉林大学第二医院伦理学委员会的通过,和每一位参与的患者签署知情同意书。把分离的外周血单核细胞洗三次,并悬浮于含有0.5%牛血清蛋白的PBS中。使用潘单核细胞分离试剂盒对于单核细胞进行阴性选择性纯化。随后,通过荧光激活细胞分选分析证实,分离的单核细胞纯度高于95%。分离好的单核细胞被放在含有RPM1640培养液中培养,并且培养液中还添加了10%的小牛血清,以及浓度为100U/ml的青霉素和链霉素。为了获得极性分化的巨噬细胞,我们使用100ng/ml的IFN-γ和100ng/ml的LPS对单核细胞进行刺激72h,使得他们转化成巨噬细胞。然后,放在37oC,95%空气含量,5%CO2的培养箱内进行培养。3.细胞活性检测:细胞活力测定,依据制造商的使用说明,使用细胞计数试剂盒8(CCK8)进行检测。简单地说,把细胞铺到96孔板中,每孔的细胞数是5×104个,加入100μl的培养基,按照拟定的方法刺激细胞,置于37oC,95%空气含量,5%CO2的培养箱内进行培养72小时以上。细胞的活性借助于测量570nm范围的吸收光谱进行检测。4.Real-time-PCR.:使用Trizol提取总的RNA,使用Super Script第一链合成系统把2ug的总RNA合成c DNA用于做RT-PCR。带有SYBR-Green荧光与c DNA和对应的引物结合,通过实时PCR技术进行检测。临时的c DNA经95oC 10分钟变性后,经历40个循环(在95°C下,变性1分钟,在60oC下,退火1分钟,在72℃,并延长2分钟)。目标基因的表达水平通过对比标准化的GAPDH CT值的方法进行测量。5.流式细胞术:轻轻刮下巨噬细胞并收集,然后用含有冷的1%BSA的PBS液洗一遍。每105个细胞加入1ug人的Ig G抗原,在4oC温度下,对细胞进行封闭30分钟。接着,分别加入单克隆抗体CXCR7、CXCR4、CXCR3,在4oC下孵育30分钟。最后,洗细胞然后用流式细胞仪对处理细胞进行分析。CXCR7、CXCR4、CXCR3的表达水平与平均荧光强度相关。6.免疫印迹法(Western Blot法):检测CXCR7的蛋白水平表达。7.酶联免疫吸附测定:对于上清中的MCP-1、IL-6、CCL18、IL-10等细胞因子通过ELISA测定。8.si RNA转染:人类PPARγ、PPARα、CXCR7、CXCR4和非目标(乱序)si RNAs从Qiagen获得。使用Transmessenger的转染试剂盒按照说明转染巨噬细胞。9.巨噬细胞趋化性检测:细胞趋化实验使用6.5毫米Transwell并带有5微毫米微孔的过滤膜的组织培养皿。5×106 cells/ml的巨噬细胞悬浮于含有0.5%BSA的RPMI 1640培养基中,把100μl的细胞悬浮液加入带有带有微孔膜的Transwell中。培养孔的下层间隔加入600μl含有SDF-1,I-TAC,TC14012等趋化因子的培养液,培养板孵育180分钟。固定细胞后,用三步染色法套装进行染色。仍然残留在上层的巨噬细胞用棉棒轻轻擦掉。而在下层的巨噬细胞是有趋化性的细胞,需要计数。迁移的细胞在高倍视野下(400×)随机选择5个区域进行计数。趋化指数的计算是用迁移到样品培养基中的细胞数除以迁移到对照培养基中的细胞数。为了进行激动剂或者拮抗剂的检测,细胞分别进行PPARγ激动剂罗格列酮和拮抗剂T0070907预处理,然后加入到上层的分离室内。吡格列酮的预处理时间是24小时,然后进行吡格列酮的趋化性检测。10.统计学分析:数据采用平均值±标准差。组间差异统计分析采用Student t检验和Mann-Whitney U检验进行分析,差异显著P<0.05。两个基因间的二尾Spearman相关系数是从实时PCRΔCt的数据结果计算得出。所有数据图表展示均使用Graph Pad Prism 5.0软件进行分析。实验结果:体外实验结果:1.用浓度分别为0.05μM、0.2μM、1μM的吡格列酮处理分化的巨噬细胞,与无吡格列酮组(0μM)进行对比。结果显示吡格列酮组显著降低巨噬细胞中CXCR7的m RNA和蛋白水平表达。随后,通过设置0、1、6、12、24小时5个时间点检验吡格列酮对CXCR7表达的影响,结果显示在12小时和24小时,(1μM)吡格列酮组显著抑制CXCR7的m RNA和蛋白水平表达,大于0小时的3倍。2.除了对已分化的巨噬细胞进行检测,我们还从侧面分析单核细胞向巨噬细胞转化的过程中CXCR7 m RNA的表达水平,结果显示在IFN-γ和LPS存在的条件下,单核细胞向巨噬细胞转化的过程中,吡格列酮同样抑制CXCR7的表达,从而降低CXCR7 m RNA和蛋白表达水平。RT-PCR和FACS结果显示,与CXCR7相比,无吡格列酮组中CXCR4和CXCR3的表达水平明显偏低,经过吡格列酮处理后仍旧没有明显改变,也就证明在巨噬细胞中,吡格列酮不改变CXCR4和CXCR3的表达。3.PPARα和PPARγ可以被转染后的si RNAs成功沉默,但scramble control si RNAs则无效。在沉默PPARγ的巨噬细胞中,吡格列酮无法抑制CXCR7的表达,而沉默PPARα后,并不影响吡格列酮抑制CXCR7的表达。为了进一步证明吡格列酮确实通过PPARγ来抑制CXCR7的表达。所以我们分别使用PPARγ激动剂罗格列酮和PPARγ抑制剂T0070907,数据显示使用PPARγ抑制剂T0070907确实抵消了吡格列酮抑制CXCR7基因表达的作用,反之,使用PPARγ激动剂罗格列酮增强了吡格列酮抑制CXCR7基因的表达的作用。4.无吡格列酮组在SDF-1,I-TAC,TC14012的诱导下,可明显观察到巨噬细胞活跃的趋化性,反之,吡格列酮组巨噬细胞的趋化性受到显著地抑制。5.为了更进一步确认CXCR7在巨噬细胞趋化性中的作用,我们使用si RNA的方法沉默巨噬细胞中CXCR7的表达。相对于转染的scramble control si RNA,CXCR7-si RNA显著降低了CXCR7 m RNA的表达。值得注意的是,CXCR7-si RNA并不能改变CXCR4或者CXCR3的表达。像我们预期的那样,沉默的CXCR7消除了SDF-1,I-TAC,TC14012对巨噬细胞趋化性的影响。6.为了明确,在下调CXCR7的表达,进而抑制巨噬细胞趋化性的过程中,吡格列酮激活PPARγ的必要性。先用吡格列酮对巨噬细胞处理24小时,然后我们分别加入PPARγ激动剂和抑制剂,再暴露于SDF-1,I-TAC,TC14012等趋化因子的作用下,我们的数据结果显示PPARγ拮抗剂T0070907消除了吡格列酮抑制巨噬细胞趋化性的作用,而PPARγ激活剂罗格列酮增强了吡格列酮抑制巨噬细胞趋化性的作用。7.使用CCK8来检验巨噬细胞活性,结果显示,吡格列酮的浓度从0、0.01、0.1、1、10μM,对细胞的活性均不产生影响。而处理时间从12小时延长至72小时,细胞活性同样没有影响。同时,对几个巨噬细胞分化标志物的表达进行分析,包括M1标志物如MCP-1和IL-6,以及M2标志物如CCL18和IL-10,吡格列酮不会影响它们的m RNA和蛋白水平表达。体内试验结果:1.我们使用RT-PCR技术,从经过吡格列酮治疗和非噻唑烷二酮类治疗的患者的颈动脉粥样硬化斑块处提取RNA,进行检测。吡格列酮的平均治疗时间为60天。相比于非噻唑烷二酮类治疗的患者,吡格列酮治疗显著降低了粥样斑块内CXCR7、SDF-1和I-TAC的m RNA的表达,相反PPARγ的表达则显著升高。2.在颈动脉粥样硬化病变中,吡格列酮的血清浓度与CXCR7的表达呈负性相关,这也就表明在体内试验中吡格列酮能够抑制CXCR7的表达。结论:1.吡格列酮抑制巨噬细胞中CXCR7的表达是通过激活PPARγ而不是PPARα2.吡格列酮通过下调CXCR7的表达从而抑制巨噬细胞的趋化性3.吡格列酮调控CXCR7并抑制巨噬细胞的趋化性,但不影响巨噬细胞的活性和分化4.吡格列酮通过激活PPARγ抑制人颈动脉粥样斑块内CXCR7的表达