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目的： 以IL-12作为分子佐剂，与结核杆菌新抗原Mtb8.4基因连接形成嵌合分子，将其克隆到真核表达质粒中，构建成嵌合DNA疫苗，研究其在小鼠体内诱导细胞免疫应答的效果及对C57BL／6N小鼠的免疫保护作用，为寻求安全、有效、廉价的结核病新疫苗打下基础。 方法： 1．Mtb8.4真核表达质粒的构建及鉴定：用PCR方法从结核杆菌标准株H37Rv基因组中扩增出Mtb8.4基因（包含或不含信号肽），亚克隆入真核表达质粒pcDNA3.1（+），构建成重组质粒pcDNA3.1（+）-Mtb8.4（pM）或pcDNA3.1（+）-MS（pMS），用酶切、PCR和DNA序列分析进行鉴定。 2．Mtb8.4／hIL-12嵌合质粒的构建及鉴定：先以pM和pMS重组质粒为模板，用PCR方法扩增出带有接头（linker）的Mtb8.4基因（Mtb8.4-linker和MS-linker，无终止密码），亚克隆入真核表达质粒pCI-neo中，构建成重组质粒pCI-neo-Mtb8.4-linker（pML）和pCI-neo-MS-linker（pMSL）；再以pORF-hIL12质粒为模板，扩增出hIL-12基因，将其亚克隆入pML或pMSL，构建成嵌合质粒pCI-neo-Mtb8.4／hIL-12（pMI）或pCI-neo-MS／hIL-12（pMSI），用酶重庆医科大学博士学位论文中文摘要 切、PCR和DNA序列分析进行鉴定。3.重组质粒在真核细胞中的表达:pM、pMS、pMI和pMsl重组质粒 用LIPoFEcTAMINATMZo0O脂质体转染试剂转染COS一7细胞，进行 瞬时表达，48小时后，用Rl’- PCR检测目的基因在mRNA水平的表 达;用westem blotting检测hIL一12在蛋白质水平的表达。重组质粒 pM、pMS转染ps 15细胞，进行稳定表达，G4 18筛选抗性克隆后， 用Rl’- PCR检测目的基因在mRNA水平的表达。4.质粒DNA免疫C57BL/6N小鼠:分11组，每组8只，分别注射: A:PM 1 00 pg，B:PMS 1 00 pg，C:PMI 1 00 pg，D:PMSI 1 00 pg，E:PM 50 pg+PORF一hIL一12 50 pg，F:PMS 50 pg +P ORf一hxL一2 2 50 pg，o:BeG 1 x lo6eFuH:pORF一hIL一22 200 p 91:PCI一neo 100 pg，J:PeDNA3.l（+）100 pg，K:PBS 10Op l。BCG免疫1次作为阳性对照;质粒DNA免疫3次，间隔时间3 周，最后1次免疫后4周，每组处死3只小鼠，用乳酸脱氢酶释放 法检测小鼠脾细胞Mths.4特异性CTL活性;并于体外用PPD刺激 小鼠脾细胞，ELISA检测脾细胞培养上清中IFN一Y、IL一2和IL一4 的分泌量。5.重组质粒对小鼠的免疫保护效果:质粒DNA最后l次免疫后4周， 用结核杆菌标准株H3 7Rv经尾静脉攻击，攻击后4周，处死小鼠， 取小鼠部分肺和脾匀浆，涂片后Z一N染色查抗酸杆菌，根据涂片结 果按一定比例稀释，接种L一J培养基，37℃培养4周后进行结核杆 菌菌落计数。另外，取小鼠部分肺和脾制作病理切片，HE染色观察 组织病变程度，抗酸染色查组织内结核杆菌。重庆医科大学博士学位论文中文摘要结果:1.重组质粒的鉴定:经酶切、PCR和DNA序列分析鉴定证实pM、pMS、 pMI、pMSI质粒构建成功。2.重组质粒在真核细胞中的表达:（1） pM、pMS转染COS一7细胞， 48小时后，用RI’- PCR检测目的基因在mRNA水平的表达;转染 p815细胞，G418筛选抗性细胞克隆，用RT-PCR检测目的基因在 mRNA水平的表达，结果为阳性，说明在转录水平有目的基因的表 达。（2）pMI和pMSI转染COS一7细胞，48小时后，用RFpCR分 别检测到Mtbs.4、MS、hJL一12基因及Mtbs.4爪IL12嵌合基因在 mRNA水平的表达，但未检测到MS爪IL12嵌合基因在mRNA水平 的表达;以抗一hILZ单克隆抗体作为一抗，用Westem blotting检测 嵌合质粒pMI和pMsl转染的COS一7细胞中hIL一12的表达，结果发 现，细胞培养上清阳性，细胞裂解物阴性，说明hIL一12在细胞内表 达后分泌到细胞培养上清中。（3）对照质粒pCI一neo和PcDNA3 .1（+） 转染的细胞培养上清和细胞裂解物均为阴性。3.质粒DNA免疫小鼠脾细胞培养上清细胞因子的分泌:（l）在体外， 用PPD刺激小鼠脾细胞，检测脾细胞培养上清中的IFN一Y和IL一2 的分泌水平，结果pMI组分泌的IFN一Y和IL一2明显高于其他组（P <0.01），pMSI组、pM+pORF一班L12组、pMs+po盯一hIL12组和 BCG组IFN一Y和IL一2分泌量不及pMI组，但与其他组相比显著升 高（p<0.01），pM组和pMs组IFN一Y和IL一2分泌也明显升高，与 pORF一hIL 12组、pCI一neo组、peDNA3 .1（+）组和pBs组相比有明显 差别（p<0.01），pORF一hIL12组IFN一Y分泌有一定升高，与pCI一neo 组、pcDNA3 .1（+）组和pBS组相比有显著差别（p<0.01），pCI一neo重庆医科大学博士学位论文中文摘要 组、PcDNA3 .1（+）组和PBS组也检测到一定量的基础分泌，pMsl 组、pM+P ORF一hIL 12组、pMs+pORF一hIL 12组和BeG组xFN一Y和 IL一2分泌量差异无统计学意义（p>0.05），pM组和pMS组FN一Y 和IL一2分泌量差异也无统计学意义（p>0.05）。（2）体外用PPD刺 激72小时后检测IL一4的分泌，结果BCG组分泌最高，与其他组相 比有显著差别（p<0.01）;其他组IL一4分泌量很低，无统计学差异 （P>0 .05）。4.质粒DNA免疫小鼠脾细胞Mtbs.4特异性CTL活性:在效靶比例为