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研究背景及目的：在生理状态下，动脉中膜平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)处于细胞周期的静止期(即分化状态或称收缩表型)，其主要功能是通过细胞的收缩、舒张来调节血管的张力。在病理情况下，当血管壁特别是血管内膜受到损伤后，VSMCs的表型发生改变，收缩表型VSMCs发生去分化转变为合成表型，细胞进入分裂周期，此种状态的VSMCs可从血管中膜游走到内膜，在内膜下进一步分裂增殖，并合成和分泌大量细胞外基质，形成新生内膜。目前认为，动脉粥样斑块和动脉再狭窄发生、发展的关键是血管中膜VSMCs增殖，并从中膜迁移至内膜下而形成新生内膜。而VSMCs增殖迁移能力的获得可能与VSMCs分化及表型调控紊乱、失常有关。所以，研究VSMCs的分化及表型调控机制成为血管生理学重要的研究领域。 E1A激活基因的细胞阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)是新近被发现并克隆的。CREG mRNA在成熟分化的组织细胞中广泛表达。但在去分化的鼠胚胎干细胞、人胚胎瘤细胞却是低表达的。CREG可直接与外源性腺病毒蛋白E1A及哺乳动物体内转录因子E2F家族蛋白竞争性地结合在靶基因的启动子上，从而阻遏E1A和E2F对靶基因的激活作用，而E1A、E2F均具有促进细胞去分第四军医大学博士学位论文化、增殖的作用，所以CREG可能通过与EIA、EZF竞争性抑制作用而起到促进细胞分化、抑制细胞增殖的作用。那么，对EIA和EZF有阻遏作用的CREG是否亦参与调控VSMCS表型转换，抑制细胞的增殖?目前尚无不清楚。本研究以人的血管平滑肌细胞为实验模型，采用免疫印迹、亚克隆技术、Rl’- PCR等分子生物学研究方法，观察VSMCs表型转换、分化过程中CREG的表达变化，探讨CREG参与VSMCs表型调控的作用，皆在揭示vSMCs表型调控的相关机制。 实验方法:(l)构建载体、诱导表达并纯化融合蛋白及制备多克隆抗体:以人CREG cDNA为模板进行PCR扩增。将PCR目的产物酶切后与pGEX一4T-1质粒连接，挑选并鉴定阳性克隆菌，测序并进行序列比较。pGEX一4T-1/C REG重组质粒经IPTG诱导在大肠杆菌体内表达谷眺甘肤琉基转移酶(glutathiones一transferase，GsT关e既G融合蛋白。用凝胶层析介质纯化GST-CREG蛋白。以大肠杆菌表达的GST-CREG融合蛋白作为抗原，免疫家兔，制备兔抗人GST-CREG的多克隆抗血清。通过A蛋白亲和层析和GST的亲和层析纯化获得抗CREG多克隆抗体。ELISA和Westem blot分析检测抗体的效价及特异性。(2)细胞原代培养及细胞鉴定:11型胶原酶消化人胸廓内动脉中膜，收集细胞，用克隆环方法进行筛选。测定细胞的生长曲线，选择倍增时间最长、形态为纺锤样的细胞进行下一步实验。使用VSMCs细胞特异性标志物的抗体经免疫荧光染色法鉴定所筛选的细胞。(3)去血清培养诱导HITAsY细胞表型转换。采用〔3H」标记脱氧胸营(’H一TdR)参入方法测定DNA合成来反映细胞增殖变化。使用刮伤实验观察去血清培养HITASY细胞的迁移变化。采用W七stemblot观察HITASY细胞在去血清培养0一7天时SMa一actin、Calponin的表达变化。(4) CREG在去血清培养HITASY细胞定位及表达变化:使用免疫组化观察CREG在HITASY细胞内的表达变化及在HITASY细胞内表达位置。用Rl’- pcR方法检测去血清培养。~7天后H’ITASY的CREG mRNA表达变化，分别收集去血清培养0~7天的HITASY细胞，提取RNA，常规行Rl飞PCR反应。W七stem blot检测去血清培养0一7天HITASY的CREG蛋白表达变化，一抗为自制的抗CREG第四军医大学博一l:学位论文多克隆抗体。(5) CREG对HITASY细胞增殖和表型转换的作用:构建pRe/eMv-e咫。和pLNCXZ一CREG载体，采用亚克隆技术将pGEX一4T-1/CREG中CREG eDNA转入pRC/CMV和pLNCXZ载体。制备含CREG蛋白的培养液，采用磷酸钙法将pRC/CMV-CREG瞬时转染到293T细胞中，使其表达CREG蛋白并分泌到培养液中。W七stemblot分析蛋白表达量。逆转录病毒载体pLNCXZ一CREG转染HITASY细胞，经G418筛选稳定表达细胞克隆。W七stem blot分析转染细胞的CREG蛋白表达。观察pLNCxZ一cREG转染细胞的生长特性并绘制细胞生长曲线。以未转染的HITASY细胞、加293T-pRC/CMv上清培养的HITASY细胞和转染pLNCXZ的HITASY细胞为对照，BrdU参入免疫组化染色分别观察加含CREG蛋白培养液所培养的HlrEASY细胞(上清组)和转染pLNCXZ一CREG细胞(转染组)的增殖变化。与对照组相比，免疫组化染色分别观察SMa一actin在上清组和转染组细胞的表达情况。Western blot观察SMa一aetin、Calponin在上清组和转染组中的表达变化。 研究结果:(l)成功构建载体、获得纯化融合蛋白并得到特异性和高效价的抗CREG多克隆抗体:PCR扩增CREG产物的电泳结果表明所扩增的目的基因片段与预期的片段大小一致，约为670bp。PCR扩增产物与pGEX一 4T-1连接，得到含GST-CREG融合蛋白基因的重组质粒。挑取pGEX一4T-1/C REG转化的白色菌落，抽提质粒DNA行酶切鉴定证实663bp的CREG基因片段己插入到pGEX一4T-1。测序及比对结果验证重组质粒中所含的目的基因片段与GenBank中CREGcDNA开放阅读框架序列完全一致，证明该