论文部分内容阅读
心血管疾病是我国临床上的常见病,极易发展为危重病。心血管疾病的早期诊断需要结合临床症状,心电图,心肌损伤标志物检测等方面进行判断。标志物检测是临床非入侵性诊断的重要方法之一。肌红蛋白和转铁蛋白分别是目前心肌损伤患者早期诊断标志物和急性时相反应标志物,hMYO和hTRF的准确定量有助于心血管疾病病人的早期诊断和病程判断。临床上蛋白质标志物一般采用免疫分析的方法进行定量,因此相比蛋白质的质量浓度或摩尔浓度,其免疫活性浓度成为保障检测结果准确可比的关键,而从源头上建立一种准确的蛋白质免疫活性浓度绝对定量方法成为建立蛋白质免疫活性浓度精准“标尺”的核心。近年来发展起来的基于分子相互作用的无标浓度分析方法(Calibration Free Concentration Analysis,CFCA)能够满足蛋白质免疫活性浓度直接准确定量的目的,该方法基于特定单克隆抗体与蛋白质的相互作用而无需外部标准品即可准确测定能够与抗体结合的抗原浓度。本文通过研究肌红蛋白和转铁蛋白两种心肌标志物的免疫活性浓度准确定量方法,对于保证心肌诊断标志物检测结果准确可比、指导心肌损伤的早期诊断和后续治疗具有重要意义。首先,对人心肌红蛋白纯品的免疫活性浓度定量进行了研究。选择了三种不同的单克隆抗体通过CFCA法对人肌红蛋白进行定量,对抗体的固定化条件、偶联水平、芯片再生条件、最佳范围等进行优化,对方法学参数进行了考察,并与同位素稀释质谱的结果进行了比较。结果表明,在优化条件下采用三种抗体获得的肌红蛋白免疫活性浓度分别为2.985、2.912、3.032 mg/mL,与同位素稀释质谱法(IDMS)获得的人肌红蛋白浓度2.851 mg/mL相当,改变了以前报道中免疫活性浓度显著低于理化分析结果的认识,揭示出通过筛选合适表位的抗体,能够避免蛋白质高级结构及修饰对免疫分析的影响,保持免疫分析与同位素稀释质谱在被测对象上的一致性,从而有助于开发出具有量值准确、良好互换性的标准物质。建立的免疫活性浓度定量方法的日内精密度为2.50%~4.23%,日间精密度为5.85%,表现出了良好的准确度和重复性。通过获得的免疫活性浓度,准确测定了抗体与蛋白质之间的结合参数,得到解离平衡常数分别为8.97×10-9M,1.4×10-10 M,1.55 × 10-10M。实验建立了准确测定与计算免疫活性浓度的流程,探讨了不同抗体与蛋白结合效果差异的原因,研究结果揭示了免疫活性浓度与基于一级氨基酸序列质量浓度或摩尔浓度之间的关系,有助于判断标准物质在不同免疫分析系统上的互换性,从而开发出量值准确、使用范围广的蛋白质标准物质。接着,对复杂基体中心肌标志物的免疫活性浓度测定方法进行了研究。使用两种不同的单克隆抗体通过CFCA法对血清中转铁蛋白进行定量,并与纯品转铁蛋白的结果进行比较。采用MM03和MM06两种抗体测定的人血清转铁蛋白免疫活性浓度分别为1.223 mg/mL,1.064 mg/mL;方法的日内精密度分别为6.44%~7.66%,6.57%~9.07%;日间重复性分别为为7.07%,8.13%。相比之下,MM03抗体表现出较好的重复性与准确度。采用MM03抗体定量纯品转铁蛋白浓度结果为1.282 mg/mL,日内精密度为4.15%~6.86%,日间重复性为6.12%,与质量平衡法和IDMS法结果对比,检测出53.84%的活性蛋白。用该数据将血清中转铁蛋白免疫活性浓度换算到质量浓度,结果为2.271 mg/mL,与生化分析仪检测结果2.464 mg/mL相比误差在10%以内,探索了一条通过免疫活性浓度和IDMS测量换算质量浓度保证不同亲和性抗体免疫检测结果一致的途径。实验建立起复杂基体中蛋白质免疫活性浓度的准确测量方法,其无标记高通量等特点使CFCA有潜力作为一种快速准确定量血清中心肌损伤标志物的方法,对于快速诊断AMI等心血管疾病具有重要意义。