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葡萄是世界上最古老、栽培范围最广的果树之一。基于其良好的品质和巨大的栽培面积,欧洲葡萄(Vitis vinifera)在葡萄产业上占据优势地位,也创造着可观的经济效益,另一方面,欧洲葡萄绝大多数属于感病品种,尤其容易感染真菌病害而导致严重经济损失。作为世界上葡萄的起源中心之一,我国拥有大量宝贵的野生抗病葡萄种质资源。本研究以高抗病的中国野生华东葡萄‘白河-35-1’为材料获得了华东葡萄病程相关蛋白PR10.1(Pathogenesis related protein 10)基因VpPR10.1,通过分析其基因结构,对其互作蛋白的筛选及调控葡萄对霜霉菌抗性的功能进行了研究,取得的主要研究结果如下: 1.中国野生华东葡萄病程相关蛋白VpPR10.1包含有PR10家族保守的P-loop和Bet VΙ两个功能结构域,与欧洲葡萄VvPR10.1氨基酸序列一致性为96.2%。通过基因枪介导的洋葱表皮瞬时转化和PEG介导的本氏烟草原生质体转化实验表明VpPR10.1主要定位于细胞质。 2.以 VpPR10.1 为诱饵蛋白从霜霉菌诱导的中国野生复叶葡萄?留坝-8?酵母双杂交cDNA文库中筛选得到了VpPR10.1的互作蛋白VpVDAC3(Voltage-dependent Anion Channel),经过酵母双杂交回复验证,双分子荧光互补(Bimolecular fluorescence complementation,BiFC)、MBP Pull-down实验、免疫共沉淀(CoIP)共同验证了VpPR10.1与VpVDAC3的互作关系。通过PEG4000介导的本氏烟草原生质体瞬时转化体系证实了VpVDAC3定位于线粒体,VpPR10.1与VpVDAC3共定位实验说明二者在线粒体存在共表达。通过农杆菌介导的本氏烟草瞬时转化系统验证了VpVDAC3的过表达能够引起本氏烟草细胞死亡,DCFH-DA染色表明ROS介导了VpVDAC3引起的烟草细胞死亡证明了造成烟草细胞凋亡的原因与ROS的积累和Metacaspase表达有关,而VpPR10.1的存在加剧了这一过程。 3.将VpPR10.1在感病葡萄无核白(Vitis viniferaL.c.v?Thompson Seedless?)中过表达,通过接种霜霉菌发现转基因葡萄中VpPR10.1与VpVDAC3都响应了葡萄霜霉菌的侵染而表达量上调,对接种霜霉菌的转基因株系进行扫描电镜检测发现接种于转基因株系的霜霉菌的侵染受到了抑制,所接种的霜霉菌吸器数量、产孢量均减少;组织化学染色结果显示转基因株系会在病原菌侵染部位产生 ROS和胼胝质的累积,同时检测到细胞色素C的释放与葡萄中Metacaspase表达,最终引起霜霉菌侵染部位的细胞凋亡,限制活体专性寄生葡萄霜霉菌的定殖。这些结果表明 VpPR10.1 增强了寄主对葡萄霜霉菌的抗性。 4.在本氏烟草中过表达葡萄 VvMetacaspase4、VvMetacaspase5、VvMetacaspase6 基因,通过DAB染色与Typan Blue染色证实了葡萄Metacaspase过表达能够引起ROS的积累和细胞凋亡。将VpVDAC3转入拟南芥中,增强了对丁香假单胞菌pst DC3000的抗性。