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研究背景与目的表面活性蛋白A(SP-A)及表面活性蛋白D(SP-D)同属于C型凝集素(C-type lectin)蛋白家族成员,对于降低肺泡表面张力、维持肺泡扩张有重要作用；同时,SP-A及SP-D作为宿主防卫蛋白,在肺感染状态及肺天然免疫中也发挥重要作用。SP-A及SP-D可以与一系列微生物如病毒、细菌、真菌等相互作用,这些作用包括凝集病原体、增强吞噬细胞对病原体的吞噬或诱捕以及对细菌生长的直接抑制作用。更为重要的是,其可以通过作用于不同的受体,调节核因子-κB (NF-κB)等不同的分子信号途径,从而调节下游炎症因子的表达,达到调节免疫的功能。既往研究表明,SP-A及SP-D在肾脏内也有表达,其主要分布于近曲小管及集合管,但其在肾脏中的作用尚不明确。本研究组先前的研究表明,肾盂肾炎女性易感者尿液内SP-A及SP-D的含量与正常人相比降低,SP-A的基因多态性与女性肾盂肾炎的易感性相关,提示SP-A及SP-D可能在尿路感染(UTI)及肾脏天然免疫中发挥作用,但其具体作用机制目前尚不明确,值得进一步研究。本研究采用SP-A/D基因敲除小鼠(SP-A/D KO)与野生型小鼠(WT),通过致尿路感染大肠杆菌(UPEC CFT073),构建逆行性尿路感染模型,研究SP-A及SP-D在尿路感染中的作用和潜在的细胞和分子机制,评价SP-A及SP-D缺失对尿路感染的影响；并通过体外培养的人肾脏近曲小管上皮细胞观察脂多糖刺激对SP-D表达的影响,评价转染SP-D表达型质粒对脂多糖诱导人肾脏近曲小管上皮细胞HK-2表达单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的影响,进一步探讨SP-D在肾脏天然免疫中的分子机制。方法第一部分：采用致尿路感染大肠杆菌逆行性感染构建小鼠UTI模型,动物分组：SP-A/D KO±UTI,24h；SP-A/D KO±UTI,48h；WT±UTI,24h；WT±UTI,48h,阴性对照组以等量无菌PBS代替菌液。免疫印迹及免疫组织化学评估SP-A及SP-D在肾脏内的表达及分布；免疫印迹评价SP-A/D KO与WT小鼠肾脏p38磷酸化水平；细菌培养定量各组UTI模型肾脏及尿液中的细菌含量,HE染色评价各组病理改变；分别采用抗中性粒细胞抗体标记行免疫组织化学及尿液内细胞定量评价肾脏及尿液内中性粒细胞的数量；ELISA评价肾脏白细胞介素-8功能同源物KC蛋白表达水平。并于体外分别采用40μg/ml SP-A及20μg/ml SP-D蛋白作用于致尿路感染大肠杆菌,酶标仪检测细菌吸光度值变化,作用5小时后进行细菌定量培养,观察SP-A及SP-D蛋白对致尿路感染大肠杆菌生长的影响,以相同浓度牛血清白蛋白为对照。第二部分：体外培养人肾小管上皮细胞HK-2,实验分组如下：(1)脂多糖在不同浓度(0-10ug/mL)作用HK-2细胞8h。(2)5ug/mL脂多糖作用HK-2细胞不同时间(0-24h)。免疫印迹及免疫荧光检测SP-D蛋白在HK-2细胞的表达和分布。实时定量PCR和免疫印迹法检测脂多糖刺激HK-2细胞后对SP-D mRNA和蛋白表达。脂质体法转染HK-2细胞,用空载作对照,筛选稳定转染细胞系,免疫印迹鉴定稳定转染细胞系SP-D蛋白表达。采用脂多糖刺激高表达SP-D蛋白的HK-2细胞,实时定量PCRELISA检测MCP-1mRNA和蛋白表达。结果第一部分：野生型小鼠肾脏表达SP-A及SP-D蛋白。免疫组织化学示,小鼠肾脏内SP-A及SP-D蛋白主要分布于近曲小管及集合管。SP-A/D KO小鼠肾脏内p38磷酸化水平较WT小鼠高。SP-A/D KO小鼠在发生UTI时,其肾脏病理改变更重,中性粒细胞浸润更多。细菌计数显示,SP-A/D KO小鼠肾脏内及尿液内细菌量在24h及48h均较野生型小鼠显著升高(均p<0.01),对照组肾脏及尿液细菌培养未见细菌生长。SP-A/D KO小鼠肾脏内及尿液内中性粒细胞数也较野生型小鼠显著升高。野生型小鼠肾脏KC表达量在发生UTI后24h较对照组显著增加(p<0.01),感染后48h与阴性对照组相比肾脏KC表达无显著差异；SP-A/D KO小鼠肾脏内KC含量在感染后24h及48h与对照组相比,未见明显改变；野生型小鼠发生UTI后24h肾脏KC表达较SP-A/D KO显著增加。体外实验显示,SP-A及SP-D均可显著抑制UPEC的生长。第二部分：HK-2细胞及肾组织均表达SP-D蛋白及1nRNA,其在HK-2的分布主要位于核膜及胞浆。脂多糖可诱导MCP-1表达显著增高(p<0.05);并可诱导SP-D mRNA及蛋白表达显著降低(p<0.05)。转染pEE14-hSP-D质粒使HK-2细胞高表达SP-D,并可下调脂多糖诱导的MCP-1表达(p<0.01)。结论肾脏内表达SP-A及SP-D; SP-A/D KO小鼠与WT小鼠相比,其对UTI更易感,其机制可能与UTI时炎症因子分泌不足及SP-A和SP-D对致尿路感染大肠杆菌生长的直接抑制和清除有关。HK-2细胞表达SP-D蛋白及：nRNA:脂多糖可诱导SP-D mRNA及蛋白表达显著降低。HK-2细胞高表达SP-D,可下调脂多糖诱导的MCP-1表达,从而在肾脏天然免疫中发挥作用。