研究背景利用实验室检测技术从横断面人群样本中获得HIV-1新发感染率,对于监测疾病流行动态,评价干预效果,及时发现高危人群等具有重要意义。目前各国普遍应用的新发感染检测是酶联免疫方法,如BED捕获酶联免疫法(BED capture enzyme immunoassay,BED-CEIA)、亲和力方法等,均存在着耗时长,价格高,样本集中检测时工作量大等问题。本课题组前期建立了基于金标银染免疫渗滤技术能同时筛查HIV-1常规抗体和检测新发感染的快速方法,初步评价显示与商品化的酶联免疫方法具有较好的一致性和相关性,但仍没有达到实际应用效果。本研究在优化该方法的基础上,建立同时进行HIV-1/2常规抗体筛查和新发感染检测的快速方法,并尝试应用于哨点样本,获取HIV新发感染率,开发更经济、有效、实用的新发感染检测方法。研究目的一、建立和优化能同时进行HIV-1型和2型(HIV-1/2)常规抗体筛查和新发感染检测的快速方法;二、获取新发感染快速检测方法的两个参数(窗口期和假近期感染率)及其适用条件;三、评价快速检测方法进行常规HIV-1/2抗体筛查和新发感染检测的性能,并与现有的商品化试剂进行比较,开发可实时监测HIV新发感染的快速方法;初步应用快速方法检测我国江西和云南省哨点横断面人群样本,进行新发感染应用性研究,为今后该方法的使用和可能存在的问题提供理论依据。研究方法一、方法建立:以HIV gp41/gp36重组抗原和HIV-1 M组多亚型基因重组gp41抗原(rIDR-M)作为探针,应用金标银染免疫渗滤快速检测技术,建立可同时进行HIV-1/2常规抗体筛查和HIV-1新发感染的快速检测方法,优化试验体系后,用已知感染时间的HIV-1抗体阳性和HIV-2抗体阳性样本进行初步验证;二、方法评价:建立评价血清盘一阳转血清盘(包括系列阳转样本250份,感染时间大于一年的样本414份)和常规血清盘(包括NARL亲和力血清样本76份、Boca盘样本133份,国家快速检测考核品样本42份和试剂评估血清盘样本403份,以及HIV-2样本2份),其中阳转血清盘用于评价快速检测方法检测新发感染的基本性能,常规血清盘用于评价快速检测方法的总体性能。用快速检测方法分别对血清盘进行盲法检测,对检测结果与现有的商品化试剂进行比对分析,以窗口期和假近期感染率两个参数评价快速方法检测新发感染的基本性能,以方法间的相关性、一致性、检测灵敏度、特异性和功效性等指标评价新建方法的总体性能;三、应用研究:选取2014年江西省和2011年云南省HIV国家级哨点样本进行应用性评估。用快速检测方法检测两个省哨点DUS、MSM、FSW和STD四类人群的新发感染样本(江西省127份,云南省561份)。将检测结果分别与LAg-Avidity EIA和BED CEIA的检测结果进行比较,分别以相关性和一致率等指标进行评价。进一步分析2011年云南省哨点样本,按照世界卫生组织推荐的实验室检测方法计算HIV新发感染率的公式,比较三种方法在该样本中计算HIV-1新发感染率的差异。另外,通过对117份抗病素治疗样本的检测,分析抗病素治疗对快速检测方法的误判情况。研究结果一、鉴定和纯化了 rIDR-M蛋白;确定HIV-1/2重组抗原以0.5 mg/ml作为包被浓度时检测信号最佳,此探针的Cutoff值为4.00;同时将15.3 μg/ml的rIDR-M抗原制备渗滤卡,用新构建的快速方法(DIGSSA)检测基本血清盘(包括已知HIV-1感染时间的阳性样本5份、HIV-2抗体阳性血清1份和阴性样本1份),结果全部判读正确;密封保存的渗滤卡在37℃内可保存9天,即4度可保存约一年。二、快速方法的rIDR-M抗原探针的Cutoff值为3.50时区分新发和长期感染能力最佳,此时新发感染快速方法的窗口期为176天,假近期感染率为2.17%(9/414,95%CI 0.80%-3.58%);进一步评价该方法检测新发感染的性能,其与LAg-AvidityEIA的符合率为96.78%(317/346),且两方法具有非常好的一致性和相关性(Kappa=0.81,R2=0.9678),与BED CEIA的符合率为92.10%(177/213),两方法也具有较好的一致性和相关性(Kappa=0.59,R2=0.9323);快速检测方法常规HIV-1/2抗体筛查的敏感性为100%(160/160),特异性为 98.61%(283/287),功效率为 99.10%(443/447)。三、快速检测方法对江西省哨点样本常规抗体筛查判读结果全部正确;对重点人群的新发感染判读结果与LAg-Avidity EIA、BED CEIA均具有较高一致率(Kappa=0.81,0.73)和相关性(R2=0.9475,0.9234);在 MSM 人群中快速检测方法与两种酶联方法的一致性也很高(Kappa=0.88,0.74)。四、快速检测方法对云南省哨点样本常规抗体筛查判读结果全部正确;对四类重点人群的新发感染判读结果与LAg-Avidity EIA的符合率为84.62%～95.81%,Kappa值为0.45～0.81;与BED CEIA的符合率为 83.78%～93.26%,Kappa值为0.40～0.77。符合率和一致率最高的为MSM人群,最低的为DUS人群。五、快速检测方法应用第二部分的参数计算云南省DUS、MSM和FSW 3类重点人群的新发感染率分别为0.61%(95%CI 0.22-1.01)、4.04%(95%CI 2.01-6.07)和 0.28%(95%CI 0.10-0.45,经卡方检验,与 LAg-AvidityEIA、BED CEIA获得新发感染率比较没有统计学差异(P>0.05)。六、对抗病毒治疗样本的误判率为16.24%(19/117)。研究结论一、本研究建立的金标银染免疫渗滤快速检测技术可同时进行HIV-1/2常规抗体筛查和HIV-1新发感染检测。对HIV常规抗体筛查,具有高敏感性和高特异性;新发感染检测的窗口期为176天,假近期感染率为2.17%,检测结果与LAg-Avidity EIA和BED CEIA方法均具有较高的一致性和相关性。二、本研究建立的快速新发感染检测方法可为HIV-1新发感染的现场检测提供可靠、便捷和高效的工具,具有推广和应用价值。三、抗病毒治疗对快速检测方法影响较大,建议在横断面人群调查时删除抗病毒治疗样本。