PCT单克隆抗体的制备及其ELISA检测方法的初步建立

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目的:降钙素原(PCT)是一种在感染的情况下由细菌、寄生虫和真菌感染等感染诱导刺激产生释放的一种蛋白质。在健康状态下,PCT的含量处于较低的水平(<0.1 ng/mL),但是在细菌感染、脓毒症、败血症等情况下PCT水平显著升高(>2 ng/mL)。目前PCT检测在临床中得到了广泛应用,相关检测方法和产品不断涌现。但PCT检测试剂的核心成分-PCT抗体国内一直未解决,国内PCT酶联免疫检测方法的研究尚处于起步阶段。制备可用于临床的单克隆抗体和建立PCT酶联免疫检测方法是目前研究的热点。本实验旨在利用单克隆抗体制备技术,制备符合临床使用要求的PCT单克隆抗体,并用其建立PCT酶联免疫定量检测方法,为临床判别细菌性感染疾病和抗生素合理应用提供一种有效的方法和应用指导。方法:用his-hrPCT抗原作为免疫原免疫BaLb/c小鼠,间接ELISA法检测免疫效价。采用免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合制备杂交瘤细胞,利用trx-hrPCT蛋白作为包被抗体,HRP-抗鼠IgG作为酶标抗体,通过间接ELISA法筛选阳性细胞株,并通过有限稀释法筛选、获得稳定的单克隆抗体细胞株,从而制备单克隆抗体。采用双抗体夹心法筛选获得配对的PCT单抗,通过对其包被液及包被条件选择、封闭液及封闭条件选择、最佳包被抗体浓度和酶标抗体浓度确定、最佳反应时间、线性范围、批内精密性、回收率、稳定性、灵敏度及特异性、干扰因素、临床标本检测等研究,建立PCT酶联免疫双抗体夹心法的检测方法。结果:当小鼠免疫效价达到1:105后,以脾细胞与骨髓瘤细胞进行3次细胞融合,筛选得到10株阳性细胞株,通过有限稀释法3次克隆化最终获得4株阳性细胞株,分别命名为F1D5,F2H3,F3B7,F3D2。注射腹腔制备腹水,间接ELISA检测效价均达到3.2×105,以辛酸-硫酸铵法纯化抗体。标记抗体,获得一组(F1D5、F3B7)配对单抗,并以此为基础研究确定PCT双抗体夹心ELISA检测的相关条件:包被液及包被条件为0.05 mol/L、pH 9.6的CB缓冲液4℃包被12 h;封闭液及封闭条件为0.6%BSA 37℃封闭2 h;最佳包被抗体F1D5浓度为400 ng/mL,酶标抗体F3B7浓度为1:8000;37℃孵育30 min,酶标二抗孵育30 min,显色20 min的反应模式。建立的检测方法线性范围为0.5 ng/mL-10ng/mL(R2=0.9912);批内精密性小于10%;高中低值平均回收率分别为99.00%、98.68%、108.69%;稳定性检测显示:37℃可稳定保存9天;灵敏度为95.6%,特异性为97.8%;PCT阴性及阳性干扰物质对本实验结果无明显干扰;与罗氏检测试剂盒对比检测200份临床血清,显示相关性良好(R2=0.9391)。结论:获得一组配对的PCT单克隆抗体,并初步建立了双抗体夹心ELISA检测PCT的定量检测方法。
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