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球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是丝孢类害虫生物防治真菌,寄主范围极广,因而已被开发成多种制剂用于害虫生物防治。本文主要研究了球孢白僵菌脯氨酸脱氢酶BbPDH在真菌生长发育中的功能。同时还对多蛋白桥联因子1(BbMBF1)调节的抗氧化路径进行了探究。球孢白僵菌BbPDH功能研究 首先,构建单基因敲除株和回补株,并以此为基础开展表型实验和生化分析。绿色荧光蛋白和MitoTraker荧光染料共定位分析显示,BbPDH蛋白在细胞内是定位在线粒体上的。BbPDH调控球孢白僵菌生长发育和对热胁迫的应激响应。基因敲除后,除了△BbPDH2,其他的三个敲除菌株在萨氏培养基S DAY和察氏培养基CZA板上的生长都受到了抑制。更换氮源后,这三个敲除株还是表现出生长缺陷。当用NH4Cl作为氮源,TCA循环中α-酮戊二酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸分别作为碳源时,ΔBbPDH1和△BbPDH4有恢复生长的趋势。而△BbPDH3的生长速率相对野生株来说还是下降的。热激后,野生株、△BbPDH2和△BbP1 )H3菌株的生长速率分别下降了11.17%、11.83%和19.61%。但是△BbPDH1和△BbPDH4对热胁迫更为敏感。分生孢子产量测定结果显示△BbPDH2和△BbPDH3的分生孢子产量与野生株相比并无显著差异,但△BbPDH1和△BbPDH4由于生长速率变慢,产孢量会有一定程度的下降。△BbPDH1、ΔBbPDH2和△BbPDH3的芽孢产量和野生株相比并无明显差异,而ΔBbPDH4芽孢产量下降明显。除ΔBbPDH2 菌株芽孢大小没有明显改变,另外三个敲除株的芽生孢子均比野生株大。在萌发板上,各敲除株分生孢子活力均没受到明显影响。但在水琼脂糖板上,ΔBbPDH1和△BbPDH4的孢子萌发率相对野生株显著下降,△BbPDH3次之,ΔBbPDH2孢子萌发率与野生株相近。在对大蜡螟幼虫的生测实验中,除△BbPDH2,其他三个基因敲除株的毒力均呈显著下降。由此可见,球孢白僵菌四个BbPDH基因在菌株生长,耐热及致病力方面发挥着不同的作用。BbMBFl对球孢白僵菌抗氧化路径的调控多蛋白桥联因子1(BbMBF1),是一个进化上高度保守的转录辅因子,在真核生物发育和抗逆方面扮演着重要角色。我们已经证实,ΔBbMBF1在甲萘醌胁迫下生长速率变缓,RT-PCR分析在氧化胁迫条件下野生株中该基因的表达量升高。为了进一步探索BbMBF1 在甲萘醌胁迫下调节的下游靶标基因,我们比较了野生株和ΔBbMBF1的转录组。分析显示,BbMBF1调节的氧化响应基因在功能类上主要富集在代谢,细胞营救和运输方面。更重要的是,生物信息分析预测了一个假定的基序,主要分布在与代谢和解毒相关的基因的启动子上。为了获得与BbMBF1p特异性结合的转录因子,我们以提取的细胞核蛋白为样品,进行免疫共沉淀实验,洗脱下来的蛋白通过质谱分析,找到了转录因子BbAP-1。通过构建基因敲除菌株,发现与野生株相比,敲除株在甲萘醌胁迫下生长同样受到抑制。综上所述,这些结果表明球孢白僵菌的BbMBF1通过介导调节代谢和解毒路径的潜在转录因子响应氧化胁迫,为分子手段改造昆虫病原真菌提供了新的思路。