前列腺癌(Prostate cancer)是全球第二大最常见的恶性肿瘤,也是导致男性癌症患者死亡的第五大原因。自2000年以来,我国前列腺癌发病率迅速增长,平均每年的增长率为12.6%。而且,我国前列腺癌病例发现时往往处于晚期,联合术前的新辅助内分泌治疗(Neoadjuvant hormonal therapy,NNHT)可以为部分患者赢得手术机会。目前,NHT的治疗模式常采用药物去势加抗雄激素药物的联合治疗方式。比卡鲁胺(Bicalutamide)是一种非甾体类雄激素受体(Androgen receptor,AR)阻断剂,由于其与AR结合的高亲和力和高特异性以及较轻微的副作用,而成为NHT治疗的首选。虽然大部分前列腺癌患者对NHT反应敏感,但仍有部分患者初始即表现出对治疗的耐药状态。我们认为,识别与治疗疗效相关的形态学特征以及免疫组化标志物可以作为肿瘤原发耐药和新辅助治疗疗效的直接预测因素,但是目前有关此方面的研究却极少。本课题第一部分从临床实际出发,利用行根治术前新辅助内分泌治疗的前列腺癌患者的组织学样本展开一系列研究,从形态学角度,通过观察HE染色切片,结合免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)与统计学分析,识别与原发耐药相关的预测性指标。另一方面,近年来,越来越多的研究表明,microRNA(miRNA)通过参与基因的转录后调控,在多种人类肿瘤中发挥着类似癌基因或抑癌基因的作用,同时在肿瘤的浸润转移以及耐药方面均占有重要地位。MiRNA的异常表达可诱导细胞的恶性转化,促使肿瘤细胞产生耐药。尽管在肿瘤中被广泛研究,但在人类肿瘤组织中筛选与耐药相关的miRNA的研究很少。本研究的第二部分使用配对的前列腺癌新辅助内分泌治疗原发耐药与药物敏感的穿刺活检石蜡组织,通过miRNA表达谱芯片检测,筛选与耐药相关的miRNA,结合组织与细胞学验证分析、靶基因预测和生物信息分析以及药物敏感性实验,探讨miRNA在前列腺癌新辅助内分泌治疗原发耐药中的作用及分子机制,为研究前列腺癌原发耐药提供思路,为指导原发耐药的治疗提供理论依据。第一部分:前列腺癌新辅助内分泌治疗原发耐药相关的组织学特征及免疫组化标志物的识别研究报道,肿瘤的形态学特征和IHC标志物可以作为预测患者对新辅助治疗疗效的直接因素。因此,本研究从临床病理资料入手,详细分析了85例配对的行根治术前新辅助内分泌治疗,且具有完整穿刺活检加根治性切除的高风险前列腺癌病例的临床病理特征,结合HE染色切片、IHC和统计学方法,从形态学和IHC标志物两个层面进行研究,取得了如下结果:1.初步提出了一种新的评价新辅助内分泌治疗疗效的分级系统:我们首先通过观察85例配对前列腺癌病例的根治切除标本石蜡组织HE染色切片,根据治疗后改变将治疗反应量化分级,与治疗前穿刺活检组织比较,按照肿瘤细胞减少程度,制定评价标准,建立了一种5级分级系统,将病例分为药物敏感组与原发耐药组。2.筛状结构、显著核仁和导管癌分化是预测新辅助内分泌治疗原发耐药的组织学特征:为了识别与新辅助内分泌治疗疗效相关的预测性病理参数,我们通过显微镜下观察85例配对前列腺癌病例治疗前穿刺活检石蜡组织HE染色切片,分析9种常见形态学特征出现的有无,包括显著核仁(100倍光学显微镜下核仁清晰可见)、细胞多形性、印戒细胞样特征、筛状结构、导管内癌、肾小球样结构、蓝染黏液、神经周围浸润以及导管癌分化。1)x2和Fisher精确检验显示,筛状结构、显著核仁和导管癌分化在敏感和耐药组间存在显著差异,是预测前列腺癌新辅助内分泌治疗原发耐药有价值的形态学指标(p=0.036,p=0.038,p=0.014)。2)通过敏感性、特异性、阳性预测值及阴性预测值评估以上3个指标对治疗疗效的预测能力,结果显示,筛状结构的敏感性为52%、特异性为74%;显著核仁的敏感性为39%、特异性为84%;两者的阴性预测值分别为81%和79%。导管癌分化的敏感性为22%,特异性为97%,阳性预测值为71%,阴性预测值为77%。3.PETN蛋白表达缺失是预测前列腺癌新辅助内分泌治疗原发耐药的IHC标志物:我们将85例配对病例新辅助内分泌治疗前穿刺活检石蜡标本构建组织芯片(Tissue microarry,TMA),分别行AR、ERG和PTEN IHC染色。1)x2和Fisher精确检验显示,PTEN蛋白表达缺失在耐药与敏感组间有显著差异(26%vs.5%,p=0.010),提示PTEN蛋白表达缺失可以作为预测新辅助内分泌治疗原发耐药的IHC指标。2)PETN蛋白表达缺失的敏感性与特异性分别为26%和95%,阳性预测值和阴性预测值为67%和78%。4.显著核仁,导管癌分化和PTEN蛋白表达缺失联合预测新辅助内分泌治疗原发耐药的效果显著优于单个指标:我们将上述4个指标与患者是否耐药进行单因素logistic回归分析,结果显示各指标均有统计学意义。接下来,我们将上述四个指标进行多因素logistic回归筛选,其中显著核仁,导管癌分化和PTEN蛋白表达缺失三个指标进入了多因素logistic回归模型分析。为评价各指标在预测患者是否耐药中的作用,分别以各指标与患者是否发生耐药进行诊断试验,以筛选后的多因素logistic回归模型的预测概率作为新变量,与患者是否发生耐药进行诊断试验,绘制ROC(Receiver operating characteristics)曲线。结果显示,多因素logistic回归模型的预测概率曲线下面积(Area under the curve,AUC)为0.781。说明联合显著核仁,导管癌分化和PTEN蛋白表达缺失3个指标之后,多因素logistic回归模型预测概率作为患者是否发生耐药,效果明显优于单个指标。综上所述,我们发现前列腺癌诊断性穿刺活检病理参数与新辅助内分泌治疗原发性耐药之间存在一定的相关性。筛状结构、显著核仁和导管癌分化是潜在的预测前列腺癌新辅助内分泌治疗原发耐药的形态学指标;PTEN蛋白表达缺失是潜在的预测前列腺癌新辅助内分泌治疗原发耐药的免疫组化标志物;联合显著核仁、导管癌分化和PTEN蛋白表达缺失3个指标作为预测患者原发耐药的诊断指标,效果明显优于单个指标。第二部分、前列腺癌新辅助内分泌治疗原发耐药相关的miRNA的识别及其功能和作用机制研究随着高通量测序和芯片技术的发展,越来越多的研究发现,肿瘤细胞中存在着许多异常表达的miRNA。MiRNA的异常表达可诱导细胞的恶性转化,促使肿瘤细胞产生耐药。本研究通过新辅助内分泌治疗原发耐药与药物敏感的人类前列腺癌组织miRNA表达谱芯片检测,自耐药组筛选出差异表达最显著的miR-142-3p、miR-150-5p和miR-342-3p,结合靶基因预测、生物信息学分析、IHC、体外细胞学功能实验以及药物敏感性实验,详细探讨了miR-142-3p,miR-150-5p和miR-342-3p共同靶向CREB5在前列腺癌新辅助内分泌治疗原发耐药中的功能以及耐药机制,取得如下结果:1.M i R-142-3p,m i R-150-5p和m i R-342-3p在前列腺癌原发耐药组中表达下调:分别选取前列腺癌新辅助内分泌治疗原发耐药与药物敏感组各5例治疗前穿刺活检石蜡标本,行miRNA表达谱芯片检测。芯片结果显示miR-142-3p、mi R-150-5p和miR-342-3p在耐药组中下调最为显著。我们分别在27例、36例和43例前列腺癌患者新辅助内分泌治疗前穿刺活检石蜡组织中行RT-qPCR检测,验证3个miRNA的表达,结果显示,mmiR-142-3p、miR-150-5p和miR-3342-33p在原发耐药组中的表达水平显著低于敏感组。2.Mi R-142-3p、miR-150-5p和miR-342-3p抑制了前列腺癌细胞的增殖、迁移和克隆形成:为了进一步研究miR-142-3p、miR-150-5p和miR-342-3p在前列腺癌中的功能,我们在前列腺癌细胞系外源性转染3个miRNA mimics。MTS、EdU实验结果证实,与对照组相比,miR-142-3p、miR-150-5p和miR-342-3p显著抑制了前列腺癌细胞的增殖能力,但EdU实验结果显示转染miR-342-3p mimics之后,细胞的增殖率无明显改变。Transwell实验证实,过表达3个miRNA之后细胞的迁移能力显著降低,而转染3个miRNA inhibitor之后结果相反。平板克隆实验也发现,与对照组相比,过表达3个miRNA之后前列腺癌细胞的集落形成明显减少、变小。3.CREB5 是 miR-142-3p,miR-150-5p和miR-342-3p的共同靶基因:运用miRWalk、miranda、RNA22及Targetscan 4个靶基因预测软件取交集,预测出16个miR-142-3p、miR-150-5p和miR-342-3p共同调控的靶基因。公共生物信息学数据库(TCGA)对以上16个靶基因进行验证分析,结果显示,CREB5 mRNA表达水平与前列腺癌的临床分期、病理分期、Gleason评分,淋巴结转移以及生化复发呈显著正相关。我们将miR-142-3p、miR-150-5p和miR-342-3p mimics分别转染到LNCAP细胞中,western-blot结果显示转染了miRNA mimics后CREB5的表达水平明显降低,而转染3个miRNA inhibitor之后CREB5的表达水平升高。双荧光素酶实验结果表明miR-342-3p、miR-150-5p和miR-342-3p mimics可显著减弱野生型CREB5 3’UTR载体荧光素酶活性,而对突变型载体荧光素酶活性并没有影响。4.CREB5与前列腺癌的Gleason评分呈显著正相关:为了进一步探索CREB5在前列腺癌中的生物学作用,我们扩大样本在331例人类前列腺癌组织中,运用IHC方法检测CREB5的表达。结果显示,CREB5的表达与Gleason评分呈显著正相关。前列腺癌组织中CREB5的表达显著高于良性前列腺增生组织,而且随着Gleason评分的增加,CREB5的表达水平显著增强。5.CREB5促进前列腺癌细胞的增殖、迁移和克隆形成:我们在LNCAP细胞中过表达CREB5质粒,MTS、EdU和平板克隆实验数据显示,与对照组相比,前列腺癌细胞增殖活性显著增强。相反,干扰CREB5的表达之后,VCAP细胞的增殖活性降低。我们运用划痕实验和Transwell实验检测CREB5对前列腺癌细胞迁移能力的影响。划痕实验结果表明,干扰CREB5的表达,与对照组相比,细胞迁移能力明显降低,Transwell实验也显示相似的结果。6.CREB5可以降低前列腺癌细胞对Bicalutamide的敏感性:为了研究CREB5在前列腺癌耐药中的作用,我们通过Bicalutamide耐药实验检测CREB5对LNCAP细胞活力的影响。结果显示过表达CREB5降低了前列腺癌细胞对Bicalutamide敏感性,当给药浓度为32、56μM时,细胞的耐药性明显增强,IC50增加了 1 4倍(44.37 vs.63.78)。我们进一步检测了加入Bicalu tamide之后对细胞功能的影响,MTS和结晶紫实验结果显示,与对照组相比,过表达CREB5增强了 LNCAP细胞的耐药性。凋亡实验证实,过表达CREB5显著抑制了前列腺癌细胞的凋亡比率,说明CREB5促进前列腺癌细胞对Bicalutamide的耐药性部分原因可能与其抑制细胞凋亡有关。7.MiR-142-3p、miR-150-5p和miR-342-3p可以增强前列腺癌细胞对Bicalutamide的敏感性:前述实验结果证实,miR-142-3p、miR-150-5p和miR-342-3p在原发耐药的前列腺癌组织中表达水平明显低于敏感组。接下来,我们在LNCAP中加入Bicalutamide,检测3个miRNA是否与耐药相关。MTS实验表明,过表达3个miRNA mimics能够增强前列腺癌细胞对Bicalutamide的敏感性,而加入抑制剂之后结果相反。综上所述,miR-142-3p、miR-150-5p和miR-342-3p的表达水平与前列腺癌的新辅助内分泌治疗反应相关;CREB5可以促进前列腺癌细胞对Bicalutamide的耐药性,并与前列腺癌的侵袭性进展以及不良预后呈显著正相关;miR-142-3p、miR-150-5p和miR-342-3p可以提高前列腺癌细胞对Bicalutamide的敏感性,其作用机制可能是通过下调它们共同的靶基因CREB5的表达水平。