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豆状囊尾蚴病是家兔最常见和重要的寄生虫病之一,给家兔养殖业造成了严重经济损失。外泌体(exosomes)作为寄生虫和宿主信息交流的新模式,可通过其携带的活性物质调控受体细胞的功能。脊椎动物let-7c可通过调节转录因子C/EBPδ的表达,调节巨噬细胞(Mφ)向M2型极化。而且,绦虫蚴感染能诱导宿主产生Th2型抑制性免疫应答,那么这种免疫抑制是否与绦虫蚴分泌的外泌体或其let-7有关,let-7是否也通过抑制C/EBPδ的表达而调节Mφ的极化呢?为此,本论文开展了以下研究:1.通过差速离心法分离纯化了豆状囊尾蚴外泌体,电镜观察和纳米粒径追踪分析表明,获得的囊泡为豆状囊尾蚴外泌体。用豆状囊尾蚴外泌体处理RAW264.7 Mφ,结果显示,外泌体可显著抑制NO产生,促进Mφ的增殖,且IL-4、IL-6、IL-10、IL-13和Arg-1等Th2型免疫相关分子的表达显著上调(P<0.05),而Th1型免疫相关分子IL-12、IFN-γ和iNOS表达水平明显下调(P<0.05)。表明豆状囊尾蚴外泌体可促进Mφ分泌Th2型免疫相关因子。用纯化的豆状囊尾蚴外泌体和ESP分别免疫家兔,ELISA检测血清抗体和细胞因子水平,并通过人工感染豆状带绦虫评价其免疫保护效果。结果显示,外泌体组家兔血清抗体、IL-4和IL-10的水平显著升高(P<0.05),而IFN-γ和TNF-α显著降低(P<0.05)或差异不明显。家兔剖检表明,外泌体组的减虫率(24.88%)较ESP组(65.71%)明显降低。推测外泌体诱导宿主产生了Th2型细胞免疫应答。2.为明确外泌体携带的主要蛋白质和miRNAs,用蛋白质谱和小RNA测序分析外泌体组分,并进行western blot和qPCR验证。结果表明,豆状囊尾蚴外泌体携带包括14-3-3和烯醇化酶在内的87种蛋白质、41种已知miRNAs和18种新miRNAs,且5种miRNAs在外泌体中明显富集。靶基因预测显示,已知miRNAs的靶基因多与信号转导和免疫系统相关。3.鉴于外泌体含有相对富集的let-7-5p,且哺乳动物let-7c可调节巨噬细胞极化。本研究用外泌体来源的let-7-5p模拟物转染Mφ,qPCR、ELISA和western blot等分析其M1/M2型标志分子的表达。结果显示,过表达let-7-5p显著下调iNOS、IL-12和NO的表达(P<0.05),上调Arg-1和IL-10的表达(P<0.05),而敲低let-7-5p则呈相反的变化。表明let-7-5p可诱导Mφ向M2表型极化。利用软件预测和种子序列分析初步确定C/EBPδ为let-7-5p的靶基因,qPCR和western blot分析显示,过表达let-7-5p显著下调C/EBPδ的转录和表达,而敲低let-7-5p则显著上调C/EBPδ的表达。双荧光素酶报告基因检测显示,let-7-5p可与野生型C/EBPδ的3′UTR结合。敲低C/EBPδ显著下调IL-12和iNOS的表达(P<0.05),上调IL-10和Arg-1的表达(P<0.05)。说明C/EBPδ为let-7-5p的靶基因,let-7-5p通过调控C/EBPδ的表达,实现对Mφ极化的调节。综上所述,本研究分离鉴定了豆状囊尾蚴外泌体,无论体外刺激Mφ还是免疫家兔,外泌体都能诱导宿主产生Th2型炎症因子。外泌体中相对富集的let-7-5p可通过调控其靶基因C/EBPδ的表达,调节Mφ向M2型极化,产生抑制性免疫应答。说明外泌体及其let-7-5p在豆状囊尾蚴感染诱导的免疫抑制中发挥重要作用,这为揭示绦虫蚴抑制和逃避宿主免疫应答的分子机制奠定了基础。