糖代谢途径中关键调控酶果糖-6-磷酸激酶-2/果糖-2,6-二磷酸酶4（简称PFKFB4）可同时参与调控肿瘤细胞糖代谢与转录程序,对多种侵袭性转移性肿瘤的发生起到关键作用,是肿瘤发生发展机制研究热点。而现阶段PFKFB4的抑制剂结构单一且抑制活性不高,其能否成为新型有效抗肿瘤靶标仍需发现更多先导化合物加以确证。本文运用基因工程技术构建了异源表达PFKFB4的重组工程菌,经对其表达纯化工艺优化,成功分离得到高纯度人类PFKFB4目的蛋白;采用化学发光方法,通过优化Kinase-Glo试剂盒测试条件,建立了PFKFB4抑制剂体外抑制活性评价体系;采用上述抑制活性评价体系,初步筛选得到（H1-1,H1-6）苯并氧杂二噁唑类新型PFKFB4抑制剂苗头化合物(H1-1,IC50=7.98±0.24μM;H1-6,IC50=5.17±0.72μM)。具体研究内容概况如下:1、异源表达PFKFB4工程菌的构建及其表达纯化工艺优化以pET-28a（+）为载体、BL21（DE3）pLysS大肠杆菌为宿主细胞,运用基因工程技术构建了异源表达PFKFB4的重组工程菌,通过优化诱导剂IPTG浓度（0.1 mM）、诱导温度（30℃）、诱导时间（8 h）等表达条件,提高PFKFB4表达量;经摸索重组工程菌破碎功率与时间之后,采用亲和层析的方法,最终分离纯化得到纯度大于90%的人类PFKFB4目的蛋白,产率为2.64 mg/L。2、Kinase-Glo化学发光法建立PFKFB4抑制剂体外抑制活性评价体系采用化学发光方法,通过优化PFKFB4蛋白浓度（600 nM）、Mg2+浓度（50μM）、ATP浓度（4μM）、DMSO浓度（0.5%）等Kinase-Glo试剂盒测试条件,建立了PFKFB4抑制剂体外抑制活性评价体系,为其新型抑制剂筛选奠定基础。3、PFKFB4新型抑制剂苗头化合物筛选与发现采用Kinase-Glo化学发光法的PFKFB4抑制剂体外抑制活性评价体系,对课题组虚拟筛选以及后期修饰改造的潜在苗头化合物进行PFKFB4体外抑制活性评价,并对抑制活性较高的苗头化合物进行了IC50测试,初步筛选得到苯并氧杂二噁唑类新型PFKFB4抑制剂苗头化合物H1-1与H1-6(H1-1,IC50=7.98±0.24μM;H1-6,IC50=5.17±0.72μM),为PFKFB4新型先导化合物的发现提供了新思路。