论文部分内容阅读
碘对甲状腺功能的影响表现为循环碘及甲状腺内部有机碘储备状况改变了甲状腺自身的碘代谢行为及其对垂体TSH的敏感性。这种作用不依赖于垂体TSH,其目的是维持合适碘池、稳定甲状腺功能,属于甲状腺功能的自我调控作用。甲状腺激素的合成与分泌是一个连续而复杂的生理过程,主要涉及钠共转运体(NIS)、甲状腺髓过氧化物酶(TPO)、甲状腺球蛋白(TG)、及促甲状腺素受体(TSHr)等甲状腺特异蛋白及这些蛋白表达的主要转录调控因子TTF-1、TTF-2、PAX8的表达及活性。甲状腺内外碘的变化,通过各种复杂的机制,最终导致甲状腺转录因子及甲状腺特异蛋白的变化,实现甲状腺功能的自我调控。甲状腺功能调控的研究,需选择合适的实验模型。动物水平的研究由于影响因素众多,不易阐明某种因素的具体作用及机制;体外条件下,多数甲状腺细胞,呈单层细胞生长,无法形成滤泡结构,缺乏完整的激素合成、储备及分泌功能,均不是甲状腺功能调控研究的最佳选择。体外重构甲状腺滤泡,克服了上述二种模型的不足,既脱离了体内复杂的调控环境,又兼备完整的功能,是甲状腺功能调控研究理想实验模型。我们探索体外重构猪甲状腺滤泡的诱导方法,从甲状腺滤泡的形态、功能及甲状腺特异蛋白表达三方面证实体外重构猪甲状腺滤泡模型构建成功。在此基础上,利用Wenstern-blolt、RealTimeRT-PCR、ELISA、RIA等方法及免疫荧光、激光共聚焦显微镜观察、创新的甲状腺滤泡腔TG提取等技术,对高碘(HI)及低碘(LI)下甲状腺特异蛋白,甲状腺转录因子、甲状腺激素分泌、滤泡腔TG的碘化度进行深入研究,探讨碘对甲状腺功能的调控作用及分子机制,现将结果总结如下:一.猪体外重构甲状腺滤泡的构建及鉴定:1.猪体外重构甲状腺滤泡的构建方法:依照下列要点:①猪甲状腺低胰蛋白酶(0.1%)消化。②震荡法分散细胞。③1.5-3X106/L高密度、均匀接种。④接种头3天时在培养基中加入1mIU/mlTSH及15%的胎牛血清。⑤滤泡形成后改胎牛血清为10%小牛血清。经过3天的培养,即可形成了大量球状或半球状的重构甲状腺滤泡。2.体外重构甲状腺滤泡的形态学鉴定:用普通倒置显微镜可以观察到形成的圆圈样结构及细胞团,直径约10-100um;相差倒置显微镜下,圆圈样结构为半球状滤泡的贴壁面,穹窿顶由细胞构成;免疫荧光染色,利用激光共聚焦显微镜的“光学切片”作用下可以清晰地观察到细胞团是由周边的甲状腺细胞及内部的滤泡腔构成。3.体外重构甲状腺滤泡的功能学鉴定:①重构滤泡组上清液中有FT3、FT4的分泌,滤泡腔有TG的储备,而单层细胞组几乎未能检测到FT3、FT4分泌及TG储备。②重构滤泡组:高碘干预甲状腺特异蛋白NIS、TG、TPO、TSHr及甲状腺转录因子TTF-1、PAX8mRNA的表达高于低碘干预组。单层细胞组:高碘干预组上述指标表达均低于低碘干预组。二.以体外重构猪甲状腺滤泡为实验模型,研究碘对甲状腺功能的调控作用:1.高碘干预组甲状腺激素合成相关基因NIS、TPO、TGmRNA表达显著高于低碘组。2.高碘干预组培养上清液中FT3、FT4分泌显著多于低碘组。三.碘对甲状腺功能调控作用的分子机制研究:1.高碘干预组TSHr、TTF-1、PAX8mRNA表达及蛋白合成显著高于低碘组。2.①高碘干预组甲状腺滤泡腔TG碘化度高于低碘组;②高碘+ MMI(甲硫咪唑)组较单纯高碘组滤泡腔TG的碘化度显著下降;③高碘组TSHr、TTF-1、PAX8mRNA表达及蛋白合成较低碘组及高碘+MMI显著上调。④高碘+MMI组较MMI+高碘组TSHr、TTF-1、PAX8mRNA表达有升高的趋势。(高碘+MMI组:先高碘干预36h,再加入MMI;MMI+高碘组:先MMI干预36h,再加入高碘.即高碘、MMI干预顺序不同。)3.①PKA阻断组:TTF-1、TSHrmRNA表达及蛋白合成较对照组显著上调。②IP3阻断组:TTF-1、TSHrmRNA表达及蛋白合成较对照组显著上调。③PKA阻断组及IP3阻断组:NIS的表达较对照组上调。④PKA阻断组:NIS2的表达较对照组上调;IP3阻断组:NIS2的表达较对照组下调。结论:1.保持细胞膜的完整性、高密度均匀接种、增加细胞的接触、粘附、聚集的机会和能力,是体外重构甲状腺滤泡形成的关键;避免使用胎牛血清是防止甲状腺滤泡结构蜕变为单层结构,维持甲状腺滤泡形态的重要因素。2.体外重构甲状腺滤泡脱离了体内复杂环境,又具备完整的甲状腺功能,是甲状腺功能调控作用及机制研究的理想实验模型,可用于观察甲状腺滤泡形成过程,探讨甲状腺滤泡结构、滤泡内容物对甲状腺功能的调控作用。3.高碘组甲状腺激素合成相关基因NIS、TG、TPO高表达,培养上清液FT3、FT4高分泌,甲状腺激素的合成及分泌功能处于活跃状态,在滤泡层面上,碘对甲状腺激素合成及分泌功能具有促进作用。4.碘离子、MMI影响滤泡腔TG的碘化,其本身对TSHr及TTF-1的表达无直接作用;TSH/TSHr信号的CAMP/AKP及磷脂酶C/IP3途径对TTF-1、TSHr的表达亦无上调作用,TTF-1、TSHr高表达是滤泡腔TG高碘化的直接结果。5.碘离子提高了滤泡腔TG的碘化度,通过调控TTF-1,进而上调TSHr的表达,增强了甲状腺滤泡对中枢TSH/TSHr信号的敏感性,是其功能自我调控的重要途径之一。6. TG高碘化时,TSHr表达上调,滤泡对中枢信号敏感,促进了NIS、TPO、TG的表达及激素的分泌。是其功能活跃的原因之一。7.TSH/TSHr信号的不同传导途径对NIS及NIS2具有不同的调控作用,提示在NISmRNA剪接水平上中枢信号参与NIS不同亚型表达的调控。综上,我们发现:在重构滤泡这一层面上,碘影响滤泡腔TG的碘化度,通过调控TTF-1,进而上调TSHr的表达,改变了滤泡对中枢TSH/TSHr信号的敏感性。TG的碘化程度不同,滤泡对中枢TSH/TSHr信号敏感性存在差异,是甲状腺适应内外碘环境的变化,实现功能自我调控的重要途径之一;TG高碘化时,TSHr表达上调,滤泡对中枢信号敏感,促进了NIS、TPO、TG的表达及甲状腺激素的分泌。在滤泡水平上,碘通过上述机制有效促进甲状腺激素的合成与分泌。近10余来,高碘相关的甲状腺功能异常、自身免疫性甲状腺炎及甲状腺肿瘤发病率呈升高趋势。碘如何调控甲状腺功能,目前知之甚少,我们的工作为该领域的研究提供了科学实用的实验模型、拓宽了研究思路,奠定了一定的方法学基础,对探讨甲状腺疾病的发病机制及科学制定补碘策略具有重要理论和现实意义。