伪旋毛虫（Trichinella pseudospiralis）是可以感染哺乳类动物和鸟类的人兽共患寄生线虫。人类通常感染伪旋毛虫是因为食用生的或未煮熟的猪肉和其它含有伪旋毛虫感染性肌幼虫的动物。幼虫在宿主肌纤维中不能形成保护性胶原囊,由于可以感染鸟类,在自然界中呈全球性分布。伪旋毛虫无包囊这一形态上与旋毛虫的差异,导致它们在幼虫和成虫的大小、幼虫在肌纤维中运动模式、调节宿主免疫反应的能力、杆细胞颗粒的形态和分泌蛋白质含量均存在显著差异,特别是在免疫特异性的差异,值得进一步深入的研究。伪旋毛虫在入侵及寄生过程中,会排泄、分泌一些产物（ES）。由于ES产物直接暴露于宿主免疫系统,因此被认为是诱导宿主产生免疫反应的主要靶向抗原。目前研究发现ES产物在虫体穿透组织、幼虫的移行、参与免疫细胞调控、减缓凝血、消化、蜕皮、细胞外基质的降解等方面都发挥重要作用,在伪旋毛虫和宿主相互作用中扮演了重要角色。伪旋毛虫目前主要有三个代表性分离株（T4RUS、T4 AUS和T4 USA）,有研究表明对最适宿主（猪）的易感性存在很大差别,推测不同分离株ES产物对宿主免疫调控能力存在差异。因此,本实验首先利用流式细胞仪检测了猪感染伪旋毛虫不同分离株在不同感染时间点外周血中免疫细胞水平变化,以期观察伪旋毛虫不同发育时期对宿主免疫反应的调控作用。其次,利用差异蛋白质组学技术鉴定、对比分析伪旋毛虫肌幼虫和旋毛虫肌幼虫之间ES产物中显著差异表达蛋白,并对这些功能蛋白进行分析,阐述这些功能蛋白在参与寄生虫与宿主相互作用中可能扮演的角色,以期找到哪些ES蛋白参与调控宿主免疫反应,并导致伪旋毛虫抑制宿主炎症能力强于旋毛虫的可能原因。最后,采用免疫蛋白质组学技术筛选伪旋毛虫成虫和新生幼虫阶段期特异性蛋白,作为潜在的早期诊断抗原或疫苗的候选。为了观察伪旋毛虫对宿主免疫系统调控能力,我们采用了流式细胞术对感染伪旋毛虫（T4 RUS和T4 AUS）两个分离株猪外周血中CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、Treg细胞、Th17细胞、CD3⁺T细胞、CD21⁺B细胞和中性粒细胞在不同感染时间点变化及Th1和Th2型特异性细胞因子IL-2和IL-4进行检测,观察伪旋毛虫入侵对宿主体内免疫反应调控。结果显示,伪旋毛虫感染猪在早期（0-17天）主要诱导的Th2型免疫反应,特异性细胞因子IL-4显著升高。从感染第17天开始B细胞发挥了主要调节作用。Treg细胞从感染第11天开始增多,展现了对宿主免疫反应强的调节抑制作用。伪旋毛虫入侵宿主猪抑制了炎症细胞Th17水平,但在感染后期（45-60天）略有升高。T4 RUS和T4 AUS两个分离株相同剂量（10000条/头）感染猪,猪外周血中上述免疫细胞在不同感染时间水平变化趋势一致,引起相同的宿主免疫反应。T4 RUS不同感染剂量（1000条/头和10000条/头）,引起猪体内免疫细胞水平变化基本无差异。应用iTRAQ串联质谱技术,对伪旋毛虫三个分离株（T4 RUS、T4 AUS和T4 USA）以及旋毛虫（T1 ISS534）之间肌幼虫ES产物进行鉴定,共鉴定出2,591个蛋白,其中535个为可信蛋白。每两组对比分析（T4 RUS:T4 USA、T4 AUS:T4USA、T4 RUS:T4 AUS和T1:T4 USA）共有65（146）、72（98）、43（103）和28（147）显著上调（或下调）差异表达蛋白被鉴定出来,并对鉴定出来的差异表达蛋白进行生物信息学分析。在GO和KEGG Pathway富集分析中,我们发现差异蛋白参与主要的生物学过程富集在碳水化合物代谢过程、小分子代谢过程、前体代谢和能量生成和蛋白折叠。参与的主要KEGG通路富集在与糖代谢相关的糖酵解和糖异生、果糖和甘露糖代谢、淀粉和蔗糖代谢和磷酸戊糖途径等通路;与氨基酸代谢相关包括色氨酸代谢、组氨酸代谢、缬氨酸、精氨酸和脯氨酸代谢和甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢等通路;与脂肪代谢相关包括丙酸代谢、脂肪酸代谢和脂肪酸降解等通路。差异蛋白参与的这些生物学过程及通路都主要集中在能量的合成、代谢和蛋白质合成等,这些都为寄生虫的长期寄生提供支持。此外,我们发现T4 RUS:T4 USA和T4 AUS:T4 USA两组富集在溶酶体通路和过氧化物酶体通路的差异表达蛋白均下调。溶酶体在信号转导、细胞适应、质膜修复、免疫应答和许多其它基本细胞过程中发挥着重要作用。特别是溶酶体介导的降解作用有助于吞噬细胞快速清除凋亡细胞,调节宿主炎症反应。而过氧化物酶体与胞内活性氧自由基的清除相关。所有参与溶酶体和过氧化物酶体通路的差异蛋白在分离株T4 USA中表达明显高于其它两组。搜索STRING数据库我们绘制了差异蛋白互作网络图查找相互作用关系密切的蛋白,并发现F23B12.5、Hsp83、calr、T01₁1246、MDH1和Nom1等为互作网络图中重要节点与多个蛋白具有紧密的互作关系,协同行使功能。对鉴定出来的差异蛋白进行功能分类分析发现了一些参与抗氧化、抗压力、宿主免疫调节和信号传导相关的蛋白。如抗氧化的二硫键异构酶（PPI）和过氧化物酶、抗压力的热休克蛋白HSP70、HSP83、HSP beta-1和alpha-crystallin B chain（small HSP）、参与宿主免疫调节的DNaseⅡ和Ca²⁺信号传导、稳态的钙调蛋白、钙网蛋白和钙同线蛋白-1等。对比这些功能差异蛋白表达量,我们发现T4 USA分离株的蛋白表达量显著上调,高于其它三组。此外,我们发现伪旋毛虫分泌的RWD domain-containing protein 2B蛋白与能够参与宿主免疫调节激发宿主Th2型反应,抑制Th1型反应的53kDa糖蛋白（rTsP53）同源度较高（query cover为97%）,伪旋毛虫这个蛋白是否也行使相似的蛋白功能,在我们以后的研究中会进一步验证。最后,我们利用2DE-Western blot结合MALDI-TOF/TOF-MS/MS鉴定伪旋毛虫成虫和新生幼虫ES产物,通过肽指纹图谱PMF共识别出大约24个匹配的蛋白点,并确定为12种不同的蛋白。GO注释分析其主要的分子功能为DNase II活性和丝氨酸型肽链内切酶活性。对其蛋白功能分类分析发现与免疫调节相关的DNase II和丝氨酸蛋白酶、运输或储存金属离子的PCHTP蛋白、利于成虫对宿主免疫应答逃避的venom allergen 5蛋白和可以作为侵入宿主的毒力因子烯醇酶等。丝氨酸蛋白酶在马来丝虫微丝蚴ES产物中确认其具有抑制炎性细胞的聚集及炎性因子的释放,从而介导宿主的免疫抑制作用,本实验在成虫和新生幼虫ES产物中发现的多个丝氨酸蛋白酶推测可能也参与宿主免疫抑制作用,后续研究我们会继续验证。此外,筛选出的这些蛋白也可以作为潜在的早期诊断或疫苗的候选蛋白。综上所述,本研究鉴定了伪旋毛虫不同发育时期（ML、Ad和NBL）ES产物,并对其功能蛋白进行分析。对理解伪旋毛虫对宿主免疫抑制能力、寄生虫与宿主互作关系、早期潜在诊断蛋白筛选具有重要意义。