RNA干扰(RNA interference，RNAi)是真核生物体内在转录后水平调控基因表达的机制。Dicer是RNAi通路里一种重要的蛋白，它在RNAi的起始阶段通过剪切双链RNA（dsRNA）产生非编码的小干扰RNA（siRNA）和微小RNA（microRNA），其主要参与了调控内源基因的作用。牙鲆是一种重要的海水养殖鱼类。在牙鲆仔鱼向稚鱼发育过程中，会发生眼睛移位，体色及生活方式等一系列变化。外源性的甲状腺激素（TH）能够诱发牙鲆仔鱼的变态早熟，添加硫脲（TU）则会阻止牙鲆仔鱼的变态。本实验室已经分析了IGF-1、IGFBP-1和microRNA等对牙鲆变态发育过程所起的作用。国内外也在各动植物体内鉴定出了Dicer基因并研究了其内在的作用机理。但对牙鲆Dicer的鉴定以及Dicer对牙鲆生长发育的调节的报道至今未见。因此，本实验克隆了牙鲆Dicer cDNA序列并对其结构进行了分析，检测了其在牙鲆胚胎和仔鱼各发育时期、不同组织的表达以及甲状腺激素和硫脲对它的影响。同时，在最近的研究中发现，Lin-28通过结合在let-7前体的颈环上阻碍Dicer的剪切，间接的抑制了let-7的成熟。为了验证let-7d、Lin-28b、pre-let-7d1和Dicer之间的关系，本实验还在牙鲆早期发育时期中，检测了Lin-28b、pre-let-7d1和let-7d的表达水平。并在牙鲆胚胎细胞中沉默了Dicer基因，检测了胚胎细胞中let-7d、Lin-28b、pre-let-7d1和甲状腺激素的变化。以期为进一步研究Dicer在牙鲆生长发育中作用的研究提供基础性资料。本研究通过RACE PCR法成功克隆了牙鲆Dicer基因cDNA序列。包括了231bp的5’非翻译区（UTR）、663bp的3’-UTR和5691bp的开放阅读框。通过ORFFinder分析，牙鲆Dicer的开放阅读框编码了1896个氨基酸。对Dicer氨基酸序列进行蛋白质结构分析，发现其有六个高度保守的结构域，分别为DEXD/H-box、DUF283、PAZ_dicer_like、两个临近的RNaseⅢ和dsRBD结构域。将牙鲆与其他物种的Dicer基因进行氨基酸序列对比，结果显示其与人类、斑胸草雀和安乐蜥的同源性都为77%，与非洲爪蟾、罗非鱼、斑马鱼和家鼠的同源性分别为73%、89%、81%和76%。经NJ系统进化树分析，牙鲆Dicer位于硬骨鱼纲的分支上。进化树的结果也显示了Dicer从线虫到人类的阶梯进化关系。定量结果显示，牙鲆Dicer基因在牙鲆未受精卵，胚胎和仔鱼发育的各个阶段均有表达，并且多个发育时间点差异表达显著。在胚胎早期发育中，牙鲆Dicer基因在囊胚期（E2）表达量最高，之后随着发育时间逐渐降低，其中在17dph，23dph，29dph和36dph的表达水平无显著性差异。Dicer mRNA在牙鲆成鱼各组织的表达也显示，牙鲆Dicer mRNA在所有检测的组织中广泛表达，并且不同组织中的表达差异显著。Dicer基因在大脑中表达最高，是肌肉（最低）中的47.00倍（p <0.01）。其次，牙鲆Dicer在心、腮和脾脏里的表达要稍高，但彼此间无显著差异。除了上述组织以外，牙鲆Dicer在胃、肾脏、肝脏和肠的表达要高于性腺，彼此间无显著差异。本实验用TH和TU处理牙鲆变态时期的仔鱼（孵化后17天（17dph）、23天（23dph）、29天（29dph）和36天（36dph））。通过荧光定量PCR的方法，分析了在激素的作用下，Dicer在牙鲆变态发育时期表达的变化。结果发现，在17dph、23dph和29dph，用TH和TU处理的牙鲆Dicer表达都没有显著变化；用TH处理21天后（36dph）牙鲆Dicer mRNA的表达水平与正常组对比显著下降；TH和TU处理8天后（23dph）牙鲆Dicer的表达则要显著高于其他时期。在正常组里，牙鲆Dicer mRNA的表达水平在各时期都几乎一致。本实验在牙鲆早期发育时期中检测了Lin-28b、pre-let-7d1和let-7d的表达水平。定量结果显示，Lin-28b在牙鲆早期发育时期差异显著。在牙鲆胚胎发育时期表达很高，在仔鱼发育时期表达逐渐减弱，从14dph到36dph期间无显著性差异。Let-7d的定量结果则与Lin-28b相反，其在牙鲆胚胎发育时期表达很低，从3dph开始表达逐渐升高，直至29dph到达最高。而pre-let-7d1则在牙鲆各发育时期都有分布，其在胚胎发育时期E2最高；仔鱼发育时期在3dph的表达最高。对药物处理后的牙鲆仔鱼进行定量检测发现，甲状腺激素促进了Lin-28b、pre-let-7d1和let-7d的表达。出乎例外的是，硫脲也同样促进了Lin-28b和pre-let-7d1在29dph和36dph的表达。而硫脲处理的各发育时期，let-7d的表达都受到了抑制。并且在甲状腺激素处理的29dph时期，let-7d的表达同样受到了抑制。在牙鲆胚胎细胞中沉默Dicer基因，定量检测Dicer表达显著降低，表明Dicer基因沉默成功。在这个基础上，本实验检测了Lin-28b、pre-let-7d1和let-7d的表达，证明了Lin-28b和pre-let-7d1与Dicer并没有直接的作用关系，而let-7d的表达则随着Dicer的沉默显著降低。甲状腺处理的Dicer表达与对照组相比，没有显著变化。不过，沉默Dicer基因后，甲状腺激素受体TRα-A与对照组相比显著升高，暗示着它们在牙鲆变态发育中可能有一定的联系，具体作用有待进一步实验论证。因此，本实验预测了Dicer在牙鲆发育中的基因调控起到的关键作用，也初步证明了Dicer通过剪切pre-let-7d1来生成成熟的let-7d，Dicer在转录水平上不直接调控let-7d成熟；并且pre-let-7d1借助Lin-28b的结合，来抑制Dicer的剪切，从而达到调控let-7d的目的。以上实验，为进一步研究Dicer在牙鲆生长发育中的作用奠定了基础。