紫花苜蓿抗寒基因MsF-box的克隆和功能研究

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低温对植物的生长发育不利,严重影响农作物的产量,是农业生产中常见的限制因子。F-box是一类含有F-box基序(motif)在泛素介导的蛋白质水解过程中具有底物识别特性的蛋白质。F-box蛋白在逆境胁迫应答中发挥重要作用。本研究从紫花苜蓿中克隆得到MsF-box基因,将其连至表达载体pCBM,并对模式植物拟南芥和烟草进行遗传转化,为研究F-box基因的功能奠定基础。主要研究结果如下:1.MsF-box基因的克隆与生物信息学分析利用RT-PCR的方法从紫花苜蓿中克隆得到了MsF-box基因的全长cDNA,MsF-box基因的全长为1422 bp,该基因编码473个氨基酸。该蛋白有一个F-box基序,以及6个LRR结构域。将其氨基酸序列在NCBI中Blast分析,发现与MtF-box(蒺藜苜蓿,XP003626345)相比,氨基酸具有同源性,相似性为96%。2.MsF-box基因的植物表达载体构建构建MsF-box基因的植物表达载体pCBM-MsF-box。含有花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子和草丁膦筛选标记基因bar。3.MsF-box基因对植物的遗传转化(1)MsF-box基因对烟草的遗传转化将pCBM-MsF-box质粒转入农杆菌EHA105中,采取农杆菌侵染叶盘法完成对烟草的遗传转化。将烟草叶盘置于添加1.1 mg/L草丁膦的筛选培养基上,进行筛选。待长出不定芽后,将不定芽移置生根培养基中进行生根,获得抗性植株。(2)MsF-box基因对拟南芥的遗传转化将pCBM-MsF-box质粒转入农杆菌EHA105中,采用农杆菌侵染花序法完成对拟南芥的遗传转化,待果荚成熟后收获种子。得到的拟南芥种子置于40μmol/L草丁膦的筛选培养基上,进行筛选,获得抗性幼苗。移抗性幼苗于蛭石中,收取种子。4.转MsF-box基因植物的分子检测和抗寒性分析经MsF-box基因内部引物和35S::Bar引物PCR鉴定获得烟草阳性苗9株,拟南芥阳性苗20株。对转基因烟草(L8和L35)和拟南芥(L8)进行冷胁迫处理,冷胁迫下,与野生型相比,转MsF-box基因株系表现出更强的抗寒能力。
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