[目的]左室功能进行性减退是慢性心力衰竭（CHF）的特征之一,由于心输出量减少,重要器官血液灌注不足,导致神经内分泌系统的代偿性激活,其中包括交感神经系统、肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）和血管加压素（AVP）。这些代偿机制有助于保持重要器官的血液供给,但是长期神经内分泌过度激活可能带来更为严重的后果。心输出量减少,血液重新分配,使得肾脏灌注不足,导致肾小球过滤率减少,肾小管对水、钠重吸收增加,水钠潴留可能引起全身水肿、肺淤血等严重并发症,显著增加CHF患者的病死率。目前水钠潴留的发病机制尚未完全清楚,过度激活的RAAS被认为在其中发挥了重要的作用,但是临床常会遇到CHF患者出现的低钠血症,这并不能完全为RAAS所解释。因此,在CHF时,水的重吸收并不是一种完全依赖于钠重吸收的被动过程,在这里面水调节缺陷可能发挥了重要的作用。AVP是由下丘脑分泌的一种激素,在循环血量减少、动脉血压下降或者血浆渗透压升高时,AVP分泌会增加,维持机体必需的血容量。CHF患者体内神经内分泌过度激活,其中也包括血浆AVP代偿性升高,此时血浆AVP升高主要是受到非渗透性刺激,也就是来自循环血量减少、动脉血压降低的刺激。已有研究表明,血浆AVP可以通过肾脏集合管上特异性受体—V2-受体（V2-R）,调节肾脏水通道蛋白-2（AQP-2）的表达量以及AQP-2的重新分布,使得肾脏集合管上皮细胞对水的通透性提高,显著增加肾脏集合管对水的重吸收。水通道蛋白家族（AQPs）是一组存在于动物、微生物细胞膜上转运水的特殊蛋白,由一系列具有同源性的膜蛋白组成,属于跨膜通道蛋白家族成员,迄今已从哺乳动物中鉴定的水通道蛋白共有13种（AQPO—AQP12）,其中AQP-2是调节肾脏水平衡的重要水通道蛋白,位于肾脏集合管主细胞的基底膜和胞质囊泡中。在血浆AVP的调控下,AQP-2完成肾脏集合管对水的重吸收,从而稳定机体水平衡。目前认为,肾脏集合管对水的重吸收主要是通过AQP-2的短时调节和长时调节完成的,短时调节是指AVP在肾脏集合管主细胞膜上与V2-R受体特异性结合,促使AQP-2由胞浆囊泡向管腔膜转移,并通过胞吐作用嵌入管腔膜,使得管腔膜上的AQP-2密度增加,从而提高管腔膜对水的通透性,增加集合管对水的重吸收,此过程可以在数分钟内完成,而且是可逆性过程。可见通过短时调节,使AQP-2在集合管主细胞内发生重新分布。长时调节是指血浆AVP水平持续升高,作用于细胞内腺苷酸环化酶,激活cAMP作为第二信使,增加AQP-2基因的转录与AQP-2蛋白的合成。由于集合管重吸收是尿液浓缩的最后一步,因此,在血浆AVP调控下,AQP-2在集合管对水的重吸收决定了尿液浓缩程度。值得注意的是,肾脏AQP-2的表达和穿梭不仅存在AVP依赖性机制,也存在非AVP依赖性机制。近年来,越来越多的研究表明,肾脏AQP-2除了接受AVP调节之外,肾上腺皮质激素、血管紧张素Ⅱ以及低钾、脱水等病理因素也参与了肾脏AQP-2表达的调节。此前,我们的研究已经证实,在CHF大鼠体内,非渗透性压力感受器刺激AVP分泌,继而AVP上调肾脏集合管上AQP-2的表达,引起。肾脏对水的重吸收增加,导致水潴留,甚至出现低钠血症。因此,向下调节肾脏AQP-2的表达,可能是纠正CHF患者水潴留、缓解临床症状、改善心脏功能的靶点之一。中医药是我国一个宝贵的医学资源,在某些临床疾病治疗中,中药的合理使用可以起到很好的效果。目前国内外研究主要集中在西药对于肾脏AQP-2的影响,对中药方面的研究较少。茯苓作为一种传统药材,在祖国医学中常被用作消肿、利湿药物,它的促肾排水的效果显著。我们前期药物试验发现,茯苓可以显著增加正常大鼠尿量,同时显著减少大鼠肾脏AQP-2的表达,所以本课题选用茯苓作为研究对象,观察它对CHF大鼠的利水渗湿作用是否通过抑制肾脏AQP-2基因的转录和表达来实现的。同时本课题还选取临床常用髓袢利尿剂—速尿作为对照,观察茯苓和速尿对CHF大鼠肾脏AQP-2表达的短期和长期影响。此外,近年来中医药治疗CHF的方剂很多,有研究证实,芪苈强心可以改善CHF患者心脏功能、显著增加尿量、有效的缓解呼吸困难等症状。因此,本研究也选用芪苈强心作为干预药物,观察它对CHF大鼠尿量及肾脏AQP-2表达的影响。总之,本研究拟从分子生物学水平研究中药茯苓、芪苈强心改善CHF大鼠心脏、肾脏功能的作用及其机制,为临床应用茯苓、芪苈强心治疗CHF提供更深入的理论依据,为减少CHF的发生,缓解CHF的症状,开辟一种崭新的治疗方法。[方法]1.AQP-2抗体合成与CHF大鼠模型制作根据相关文献,人工合成AQP-2蛋白C末端的CELHSPQSLPRGSKA多肽片段,将AQP-2多肽与钥孔血蓝蛋白（KLH）相连后免疫家兔,获得兔抗鼠AQP-2多克隆抗体,并将AQP-2多肽与牛血清白蛋白偶联作为标准品。本研究选用雄性SD大鼠,采用结扎大鼠冠脉前降支致急性心肌梗死（AMI）模型,4周后存活大鼠经小动物超声心动图评定心脏功能,确定CHF大鼠造模成功。2.标本采集在实验过程中,大鼠均单独饲养在代谢笼中,自由进食水,定时收集24h尿液标本。记录大鼠每日尿量,测定尿渗量和尿液AQP-2排泄率。实验结束时处死大鼠,收集血液标本,检测血钠、钾、肌酐、渗透压及血浆AVP、脑利钠肽（BNP）等指标;同时快速摘取大鼠肾脏,大体分离肾脏皮质、髓质,将组织标本液氮冷冻后,放—80℃冰箱保存,以备实时荧光定量PCR（Real-time PCR）、免疫印迹法（Western blotting）及免疫荧光等实验。3.实验分组和处理将CHF大鼠随机分组为8组,每组再根据治疗时间长短,分为2个亚组。模型组（CHF）:分为治疗1周组（CHF-1,n=9）和治疗4周组（CHF-4,n=9）,给予CHF组大鼠生理盐水8 ml·kg^-1·d^-1灌胃。茯苓大剂量治疗组（HH）:分为治疗1周组（HH-1,n=9）和治疗4周组（HH-4,n=9）,给予HH组大鼠茯苓2.4 g·kg^-1·d^-1灌胃。茯苓中剂量治疗组（HM）:分为治疗1周组（HM-1,n=8）和治疗4周组（HM-4,n=9）,给予HM组大鼠茯苓1.2 g·kg^-1·d^-1灌胃。茯苓小剂量治疗组（HL）:分为治疗1周组（HL-1,n=8）和治疗4周组（HL-4,n=9）,给予HL组大鼠茯苓0.6 g·kg^-1·d^-1灌胃。速尿治疗组（F）:分为治疗1周组（F-1,n=9）和治疗4周组（F-4,n=9）,给予F组大鼠速尿20 mg·kg^-1·d^-1灌胃。芪苈大剂量治疗组（QH）:分为治疗1周组（QH-1,n=8）和治疗4周组（QH-4,n=9）,给予QH组大鼠芪苈1.0 g·kg^-1·d^-1灌胃。芪苈中剂量治疗组（QM）:分为治疗1周组（QM-1,n=8）和治疗4周组（QM-4,n=9）,给予QM组大鼠芪苈0.5 g·kg^-1·d^-1灌胃。芪苈小剂量治疗组（QL）:分为治疗1周组（QL-1,n=9）和治疗4周组（QL-4,n=9）,给予QL组大鼠芪苈0.25 g·kg^-1·d^-1灌胃。另设对照组（CTL）:分为治疗1周组（CTL-1,n=10）和治疗4周组（CTL-4n=10）,给予CTL组大鼠生理盐水8ml·kg^-1·d^-1灌胃。4.实验方法实验一,对CHF大鼠分别应用大剂量茯苓(2.4 g·kg^-1·d^-1)、中剂量茯苓(1.2g·kg^-1·d^-1)、小剂量茯苓(0.6 g·kg^-1·d^-1)和速尿(20 mg·kg^-1·d^-1),经胃灌入,大鼠置入代谢笼,自由进食水,连续收集24h尿液,记录尿量,用间接ELISA检测尿液AQP-2,冰点抑制法测定尿渗量;分别在用药后1周、4周,用小动物超声心动图评价大鼠心脏功能,然后分批处死大鼠,采集血液标本,检测血K⁺、Na⁺、Cr、AVP、BNP、血浆渗透压;提取大鼠肾脏髓质用Real-time PCR测定V2-RmRNA、AQP-2 mRNA表达,Western blotting测定AQP-2蛋白表达。实验二,用大剂量芪苈强心(1.0 g·kg^-1·d^-1)、中剂量芪苈强心(0.5g·kg^-1·d^-1)、小剂量芪苈强心(0.25 g·kg^-1·d^-1)治疗CHF大鼠,连续收集24h尿液,记录尿量,用间接ELISA检测尿液AQP-2的变化;分别在用药后1周、4周,超声心动图评价心脏功能,然后处死大鼠,采集血标本,做血生化及激素测定;提取大鼠肾脏髓质用Real-time PCR测定V2-R mRNA、AQP-2 mRNA表达,Westernblotting测定AQP-2蛋白表达。[结果]1.CHF大鼠肾脏AQP-2和心脏功能的变化CHF组大鼠24h尿量较CTL组显著降低,尿渗量显著升高（P＜0.01）;血浆AVP浓度显著升高,同时肾脏髓质V2-R mRNA、AQP-2 mRNA和蛋白表达均较CTL组显著增加（P＜0.01）。超声心动图显示,CHF组大鼠LVEDd、LVEDs值较CTL组显著升高,FS、EF值显著降低;同时CHF组大鼠血浆BNP浓度显著升高（P＜0.01）。2.茯苓对CHF大鼠肾脏AQP-2和心脏功能的影响HH-1组、HM-1组、HL-1组大鼠治疗前后,尿量有显著性差异,3组尿量均随着用药时间延长而增加（P＜0.01）。经过1周茯苓治疗后,HH-1组、HM-1组、HL-1组大鼠肾脏髓质AQP-2 mRNA和AQP-2蛋白表达均较CHF-1组显著下降（P＜0.01）,而且HH-1组较HM-1组、HL-1组降低更加显著,差异有统计学意义（P＜0.05）,但是3组血浆AVP、肾脏V2-R mRNA与CHF-1组比较无显著性差异（P＞0.05）。HH-1组、HM-1组、HL-1组FS、EF值及血浆BNP浓度较CHF-1组也未发生显著变化（P＞0.05）。HH-4组、HM-4组、HL-4组大鼠治疗前后,尿量有显著性差异,治疗后尿量较治疗前显著增多,尿渗量显著降低（P＜0.01）。经过4周茯苓治疗后,HH-4组、HM-4组、HL-4组大鼠血浆AVP浓度降低,肾脏髓质V2-R mRNA、AQP-2 mRNA及蛋白表达较CHF-4大鼠均显著下降（P＜0.01）;血浆BNP浓度较CHF-4组显著降低（P＜0.01）。3.速尿对CHF大鼠肾脏AQP-2和心脏功能的影响F-1组大鼠治疗前后,尿量有显著性差异,治疗后尿量较治疗前显著增多（P＜0.01）;经过1周速尿治疗,F-1组大鼠血浆AVP浓度、肾脏髓质V2-R mRNA、AQP-2 mRNA和蛋白表达较CHF-1组均无显著性差异,血浆BNP浓度、FS和EF值也未发生显著变化（P＞0.05）。F-4组大鼠治疗前后,尿量有显著性差异（P＜0.01）,其中在速尿治疗第9天,大鼠尿量达到峰值,其后尿量有所减少,但是仍高于用药前水平（P＜0.01）。经过4周速尿治疗,F-4组血浆AVP浓度较CHF-4组大鼠显著升高（P＜0.05）,同时,大鼠肾脏髓质V2-R mRNA、AQP-2 mRNA和蛋白表达均较CHF-4组显著升高,差异有统计学意义。血浆BNP浓度、左室FS、EF值未发现显著改变（P＞0.05）。4.芪苈强心对CHF大鼠肾脏AQP-2和心脏功能的影响QH-1组、QM-1组、QL-1组大鼠治疗前后,尿量有显著性差异,3组大鼠尿量均随着用药时间延长而增加（P＜0.01）。经过1周芪苈强心治疗,QH-1组、QM-1组、QL-1组大鼠血浆AVP浓度、肾脏髓质V2-R mRNA、AQP-2 mRNA和蛋白表达较CHF-1组均无显著性差异,血浆BNP浓度、FS和EF值也未发生显著变化（P＞0.05）。QH-4、QM-4、QL-4组大鼠治疗前后,尿量有显著性差异,治疗后尿量较治疗前显著增多（P＜0.01）。经过4周芪苈强心治疗,QH-4组、QM-4组、QL-4组血浆AVP浓度较CHF-4组大鼠降低,大鼠肾脏髓质V2-R mRNA、AQP-2 mRNA和蛋白表达均较CHF-4大鼠显著降低,QH-4组较QM-4组、QL-4组下降更为显著（P＜0.05）。QH-4组、QM-4组、QL-4组血浆BNP浓度较CHF-4组显著降低,差异有统计学意义。[结论]1.经过1周茯苓治疗,CHF大鼠肾脏AQP-2的表达降低,尿量显著增加,而血浆AVP和肾脏V2-R未发生显著变化,提示茯苓可能是通过抑制肾脏AQP-2的表达而发挥利湿作用的,而这一作用是通过非AVP调节途径实现的。2.经过4周茯苓治疗,CHF大鼠心脏功能改善,血浆AVP和肾脏V2-R降低,有助于降低肾脏AQP-2,此时肾脏AQP-2表达下调与心脏功能改善可能互为因果关系。3.经过1周速尿治疗,CHF大鼠尿量显著增加,而血浆AVP浓度、肾脏AQP-2表达无显著改变,说明速尿使用1周时,对肾脏AQP-2表达无显著影响。4.经过4周速尿治疗,CHF大鼠血浆AVP浓度升高,通过肾脏V2-R上调AQP-2的表达,增加肾脏对水的重吸收,而这种代偿机制可能是“利尿剂抵抗”的原因之一。5.使用芪苈强心治疗1周,CHF大鼠尿量显著增加,但是未引起血浆AVP和肾脏AQP-2表达的显著变化,提示芪苈强心可以增加CHF大鼠尿量,但是其利尿作用并非直接改变肾脏AQP-2表达所致。6.使用芪苈强心治疗4周可以改善大鼠心脏功能,降低血浆AVP浓度,通过肾脏V2-R下调AQP-2的表达,减少肾脏对水的重吸收,可能是此时CHF大鼠尿量增加的原因之一。