论文部分内容阅读
第一部分aPKC-ι、Snail表达与免疫细胞浸润及胆管癌转移和预后的关系目的:检测aPKC-ι、Snail以及免疫细胞表型分子CD4、CD8、CD25、Foxp3在胆管癌组织中的表达,明确aPKC-ι与Snail以及免疫细胞表型间相互关系,并进一步结合胆管癌病人临床资料分析其表达与临床病理特征的相关性。方法:在64例胆管癌病人组织标本中,利用免疫组化检测癌组织与癌旁组织中aPKC-ι、Snail 以及免疫细胞表型分子 CD4、CD8、CD25、Foxp3 在 mRNA和蛋白质水平的差异。卡方检验和t检验检测aPKC-ι、Snail以及免疫细胞表型分子CD4、CD8、CD25、Foxp3与胆管癌病理分化程度、淋巴结转移情况和TNM分期的关系;Spearman相关性分析法分析aPKC-ι与Snail以及免疫细胞表型分子CD4、CD8、CD25、Foxp3之间相关性;Kaplan-Meier法分析上述分子表达与胆管癌病人总体生存的关系;Cox单因素多因素回归分析胆管癌病人预后的独立影响因素。结果:aPKC-ι、Snail、CD4、CD25和Foxp3在胆管癌组织中显著高表达,在癌旁组织中低表达;CD8在胆管癌组织中低表达,在癌旁组织中高表达;aPKC-ι和Snail、CD4、CD25、Foxp3在胆管癌组织中协同高表达,且呈正相关,并且与CD8表达相反;aPKC-ι、Snail、CD4、CD8、CD25和Foxp3表达与胆管癌的病理分化程度、淋巴结转移及TNM分期密切相关;Cox单因素多因素冋归分析提示aPKC-ι、Snail、CD4、CD25和Foxp3是胆管癌预后的独立影响因素。结论:在胆管癌组织内,aPKC-ι表达水平与Snail表达水平呈正相关,提示aPKC-ι参与癌细胞上皮-间质细胞转化;aPKC-ι表达及免疫细胞浸润程度相关;aPKC-ι、Snail和免疫细胞协同促进胆管癌的发生、发展和侵袭转移,aPKC-ι、Snail、CD4、CD25和Foxp3是胆管癌预后的独立影响因素,可作为预测胆管癌预后的指标。第二部分aPKC-ι诱导胆管癌细胞上皮-间质细胞转化目的:探讨aPKC-ι对人胆管癌细胞上皮-间质细胞转化(EMT)的调控作用。方法:运用小分子技术构建aPKC-ι-cDNA表达载体,建立稳定过表达aPKC-ι的人胆管癌细胞系,采用WB、IF及qRT-PCR分别从mRNA和蛋白水平检测aPKC-ι过表达的人胆管癌细胞中上皮样标志物E-cadherin、[β-catenin和间质样标志物N-cadherin的表达情况;Transwell侵袭实验、划痕试验检测胆管癌细胞侵袭能力和迁移能力;CCK8细胞增殖实验检测胆管癌细胞增殖能力。通过转染aPKC-ι-sιRNA干扰载体入稳定过表达aPKC-ι的人胆管癌细胞系,靶向沉默aPKC-ι的表达,检测胆管癌细胞EMT表型标志物的表达以及细胞增殖、侵袭和迁移能力的变化,验证aPKC-ι对胆管癌细胞EMT的调控作用。通过构建裸鼠皮下移植瘤和肺转移模型,体内验证aPKC-ι对胆管癌细胞增殖和转移作用。结果:在体外,上调人胆管癌细胞中aPKC-ι表达,胆管癌细胞上皮样标志物E-cadherin和β-catenin表达减少,而间质样标志物N-cadherin表达明显增多;胆管癌细胞侵袭能力、迁移能力和增殖能力增强;进一步靶向沉默稳定过表达aPKC-ι的人胆管癌细胞中aPKC-ι的表达,E-cadherin和β-catenin表达恢复,N-cadherin表达降低,胆管癌细胞侵袭能力、迁移能力和增殖能力下降。在体内,稳定过表达aPKC-ι人胆管癌细胞系构建的裸鼠成瘤及转移模型中,皮下移植瘤体积明显增加;肺转移灶数目亦显著上升;IHC、WB和qRT-PCR证实该组皮下移植瘤及肺转移灶组织中aPKC-ι表达上调。结论:在体内外aPKC-ι可诱导胆管癌细胞EMT,进而促进胆管癌侵袭转移。第三部分aPKC-ι介导的胆管癌细胞EMT诱导免疫抑制目的:在第一部分实验提示aPKC-ι表达与免疫细胞浸润程度存在相关性的基础上,进一步探讨aPKC-ι对机体免疫细胞功能的影响及机制。方法:利用aPKC-ι-cDNA表达载体构建稳定过表达aPKC-ι人胆管癌细胞EMT体外模型,与健康志愿者外周血单个核细胞(PBMCs)共培育5天,CCK8增殖实验检测PBMCs增殖;流式细胞术分析CD4+细胞、CD8+细胞及免疫抑制性CD4+CD25+细胞的数量,进一步选定CD4+细胞、CD4+CD25 +细胞和CD4+CD25-细胞亚群,检测选定细胞亚群中Foxp3+细胞的数量。应用免疫磁珠分离共培育体系中CD4+CD25-细胞,与T细胞培育后,CCK8法观察其对T细胞增殖的影响。转染aPKC-ι-siRNA表达载体入稳定过表达aPKC-ι的人胆管癌细胞系,与PBMCs共培育5天,分析免疫抑制性CD4+CD25+/-Foxp3+细胞的数量。ELISA法检测不同aPKC-ι表达水平胆管癌细胞系培养液上清中免疫因子IL-2和TGF-β1的表达;并将不同aPKC-ι表达水平胆管癌细胞系培养液上清与PBMCs共培育,检测CD4+CD25+/-Foxp3+细胞的数量;进一步利用Transwell小室分隔的胆管癌细胞与PBMCs共培育,检测培养液上清中IL-2和TGF-β1的水平以及CD4+CD25+/-Foxp3+细胞的数目。结果:稳定过表达aPKC-ι人胆管癌细胞系与PBMCs共培育后,PBMCs增殖、CD4+细胞和CD8+细胞数量较阴性对照组和空白组明显下降,CD4+CD25+细胞的数量无明显变化;选定的CD4+细胞和CD4+CD25-细胞亚群中,Foxp3+细胞的数量显著增加,CD4+CD25+细胞群中,Foxp3+细胞的数量无明显改变。实验组中分离的CD4+细胞抑制T细胞增殖能力显著增强;转入aPKC-ι-siRNA的稳定过表达aPKC-ι的人胆管癌细胞系与PBMCs共培育后,CD4+CD25-Foxp3+细胞数量下降;高表达aPKC-ι的胆管癌细胞培养液上清中IL-2和TGF-β1水平较低表达aPKC-t的胆管癌细胞培养液上清中明显增加;将胆管癌细胞培养液上清或利用Transwell小室分隔胆管癌细胞与PBMCs共培育,CD4+CD25-Foxp3+细胞数明显增加。结论:aPKC-ι介导的胆管癌细胞EMT诱导免疫抑制性CD4+CD25-Foxp3+细胞增加,其一部分原因是由于胆管癌细胞分泌的免疫因子IL-2和TGF-[31对免疫细胞的影响。第四部分Snail参与aPKC-ι介导的胆管癌EMT及免疫抑制目的:探讨aPKC-ι诱导胆管癌细胞EMT以及免疫抑制的分子机制。方法:WB和qRT-PCR检测不同aPKC-ι表达水平的人胆管癌细胞系中Snail表达情况;稳定过表达aPKC-ι胆管癌细胞中转入Snail-siRNA,WB、IF和qRT-PCR检测EMT标志物表达;CCK8增殖实验、Transwell侵袭实验和划痕试验观察靶向沉默Snail对胆管癌细胞增殖和转移作用;构建稳定低表达aPKC-ι的人胆管癌细胞系,转染Snail-cDNA后检测EMT标志物的表达情况以及胆管癌细胞增殖和转移能力。靶向沉默Snail的稳定过表达aPKC-ι胆管癌细胞系与PBMCs共培育5天后,CCK8增殖实验观察其对PBMCs增殖的影响,流式细胞术分析共培育体系中CD4+细胞、CD8+细胞、CD4+CD25-Foxp3+细胞数量变化情况;免疫磁珠分离共培育体系中CD4+CD25-细胞,与T细胞培育后,观察其对T细胞增殖的影响;ELISA检测上述胆管癌细胞系培养液上清中IL-2和TGF-βi的表达情况。结果:人胆管癌细胞系中aPKC-ι表达与Snail呈正相关;过表达aPKC-ι胆管癌细胞中靶向沉默Snail后,上皮标志物表达增加,间质标志物表达下降,细胞增殖、侵袭和转移能力下降。低表达aPKC-ι胆管癌细胞中上调Snail后,上皮标志物表达下调,间质标志物表达上升,细胞增殖、侵袭和转移能力增加。靶向沉默Snail的稳定过表达aPKC-ι胆管癌细胞系与PBMCs共培育5天后,PBMCs增殖增加,CD4+细胞和CD8+细胞数目上升、CD4+CD25-Foxp3-细胞数量减少;共培育体系中分离的CD4+CD25-细胞抑制T细胞增殖能力下降;其胆管癌细胞系培养液上清中IL-2和TGF-β1的表达显著下调。结论:aPKC-ι通过Snail信号通路调节胆管癌EMT并诱导免疫抑制;靶向沉默Snail可以逆转aPKC-ι诱导的上述变化,有望成为胆管癌治疗的新靶点。