目的:赭曲霉毒素A(Ochratoxin A, OA)是自然界中的一种真菌毒素,主要由赭曲霉和青霉菌属的某些菌株产生,广泛存在于谷物和食品中,是一种具有致畸性、致突变性和致癌性的真菌毒素。目前已有研究表明,OA具有肾脏毒性、肝脏毒性和免疫毒性,尤其是其肾脏毒性比较明显,主要表现为肾小管变形退化、进行性肾纤维化和肾功能的损害,被认为是巴尔干肾病和慢性间质性肾炎的主要病因之一。c-Jun氨基末端激酶( c-Jun NH2-terminal kinase, JNK)信号转导通路是促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路之一,大量实验提示JNK信号转导通路可被细胞因子、生长因子、应激等多种因素激活,在细胞分化、细胞凋亡、应激反应以及多种人类疾病的发生与发展中起着至关重要的作用。目前,有关OA肾毒性机理的研究多集中在OA和DNA形成DNA加合物导致DNA的损伤、断裂以及OA抑制线粒体的氧化呼吸链方面,而有关JNK信号转导通路在OA诱导人肾小管上皮细胞(HKC)凋亡中作用的研究未见报道。鉴于此,本实验采用细胞培养、MTT比色法、流式细胞定量检测技术、免疫细胞化学、蛋白印迹等方法探讨JNK信号转导通路在OA诱导的人肾小管上皮细胞凋亡中的作用,揭示OA的肾毒性机制。方法1细胞培养与处理HKC细胞培养于含10%胎牛血清、105U/L青霉素、100mg/L链霉素的DMEM培养基中,37℃、5%CO2培养,细胞贴壁生长。选择对数生长期的细胞(传代后24h)随机分为空白对照组、溶剂对照组、OA处理组。OA处理组加入乙醇溶解液,终浓度为1μΜ和5μΜ,空白对照组加入生理盐水,溶剂对照组加入乙醇(1:500)。常规消化、离心收集细胞,检测各项指标。2噻唑蓝(MTT)比色法2.1 MTT比色法用于检测OA对细胞生长的影响。选择对数生长期的细胞(传代后24h)随机分为四组:空白对照组、溶剂对照组、1μΜ和5μΜOA处理组,每组6孔。在OA处理组中,分别给予上述细胞4h、8h、16h、24h、48h的处理时间。根据MTT检测结果,观察OA处理对人肾小管上皮细胞HKC生长的影响,并依此筛选出最佳的处理时间,作为本实验的处理时间。2.2选择对数生长期的细胞随机分为四组:空白对照组、溶剂对照组、1μΜOA处理组和JNK阻断剂组(JNK特异性阻断剂—SP600125 0.5μΜ+OA1μΜ),每组6孔。JNK阻断剂组给予SP600125预处理30min后,再加入1μΜOA处理细胞24h,观察SP600125对OA作用后HKC细胞存活率的影响。3流式细胞定量检测技术(FCM)给予不同浓度OA处理后,FCM检测人肾小管上皮细胞HKC细胞凋亡率。4免疫细胞化学(SP法)细胞爬片后,检测OA处理后人肾小管上皮细胞HKC中凋亡相关蛋白caspase-3的表达以及JNK、p-JNK的表达情况。5蛋白免疫印迹(Western Blotting)提取细胞总蛋白,用蛋白印迹方法,检测OA处理后人肾小管上皮细胞HKC中凋亡相关蛋白caspase-3的表达情况及JNK、p-JNK的表达情况。结果1 OA对体外培养HKC细胞生长的影响MTT检测结果表明,OA对HKC细胞的生长有一定抑制作用:给予1μΜ、5μΜOA分别处理4h、8h、16h、24h、48h后,各时间点HKC细胞存活率均较对照组(100%)降低,尤其以24h OA处理组细胞的存活率降低更明显(P<0.05),1μΜ、5μΜOA处理24h细胞存活率分别为51.09%,53.38%。根据MTT检测结果,选择24h作为本研究的处理时间。2 OA对体外培养HKC细胞凋亡的影响2.1 FCM检测细胞凋亡率FCM DNA定量检测结果显示,HKC细胞经OA处理24h后,1μΜ、5μΜOA处理组细胞凋亡率分别为3.85±0.29%和4.86±0.51%,均高于对照组(1.23±0.05% )(P<0.05)。2.2凋亡相关蛋白―Caspase-3的表达2.2.1免疫细胞化学染色检测Caspase-3蛋白表达Caspase-3蛋白阳性染色为棕黄色颗粒,定位于HKC细胞胞浆内。免疫细胞化学染色可见, 1μΜ和5μΜOA处理组Caspase-3阳性细胞表达率分别为54.03±9.21%、60.75±9.95%,较对照组(14.31±4.24%)显著增加(P<0.05)。2.2.2蛋白免疫印迹检测Caspase-3蛋白表达Caspase-3蛋白分子量为32kD,经SDS-PAGE电泳、转膜后,空白对照组、溶剂对照组、OA处理组均在32kD位置出现了棕色的阳性条带。以β-actin(42KD)作为内参照,采用图像分析系统对杂交条带进行定量分析,结果表明,OA处理可以诱导体外培养HKC细胞Caspase-3蛋白表达。3 OA对体外培养HKC细胞磷酸化JNK(p-JNK)表达的影响3.1免疫细胞化学染色检测p-JNK的表达p-JNK定位于HKC细胞胞浆和胞核内。免疫细胞化学染色可见, 1μΜ、5μΜOA处理组p-JNK阳性细胞表达率分别为53.31±11.01%和58.53±11.11%,明显高于对照组(10.19±6.85%)(P<0.05)。3.2蛋白免疫印迹检测p-JNK的表达p-JNK是JNK的活化形式,由p-JNK1、p-JNK2、p-JNK3组成。p-JNK1蛋白分子量为54kD;p-JNK2、p-JNK3蛋白分子量为46kD,经SDS-PAGE电泳、转膜后,HKC细胞空白对照组、溶剂对照组、OA处理组均在54kD、46kD位置出现了两条棕色的阳性条带。经图像分析系统对杂交条带进行定量分析,结果表明,OA处理可以使HKC细胞p-JNK表达增高。4 OA对体外培养HKC细胞JNK表达的影响4.1免疫细胞化学染色检测JNK的表达JNK定位于HKC细胞胞浆内。免疫细胞化学染色可见,与对照组相比,1μΜ和5μΜOA处理组JNK阳性细胞表达率无明显变化(P>0.05)。4.2蛋白免疫印迹检测JNK的表达JNK由JNK1、JNK2、JNK3组成,JNK1蛋白分子量为54kD,JNK2、JNK3蛋白分子量为46kD。经SDS-PAGE电泳、转膜后,HKC细胞对照组、OA处理组均在54kD、46kD位置出现了棕色的阳性条带。经图像分析系统对杂交条带进行定量分析,进一步证实给予OA处理后,体外培养的HKC细胞JNK的表达无明显变化。5 JNK特异性阻断剂—SP600125对OA处理后HKC细胞存活率的影响MTT检测结果发现,JNK阻断剂组(SP600125预处理+OA)HKC细胞的存活率(82.09%)明显高于OA处理组66.83%(P<0.05),但低于溶剂对照组(98.58%)(P<0.05),说明SP600125对OA致HKC细胞损伤具有部分阻断作用,提示OA可能通过JNK信号转导通路参与介导细胞死亡的过程。结论1 OA可以促进体外培养HKC细胞Caspase-3蛋白的表达,诱导细胞凋亡。2 OA可以促进体外培养HKC细胞p-JNK的表达,提示JNK信号转导通路可能参与OA诱导的HKC细胞凋亡。3 SP600125预处理对OA致HKC细胞损伤具有部分阻断作用,OA可能通过JNK信号转导通路参与介导细胞死亡的过程。4研究结果提示,OA处理可促进体外培养人肾小管上皮细胞发生凋亡,其机制可能为:激活JNK信号转导通路,进而上调Caspase-3蛋白的表达。