马尾松WRKY、MYB和AP2/ERF基因家族鉴定及干旱胁迫下表达模式研究

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马尾松(Pinus massoniana Lamb.)分布于我国17个省市自治区,是我国南方重要用材树种,具有重要经济价值。其自身具有一定抗逆境能力,尤其是抗旱、耐瘠薄,同时具有适应能力强、综合利用程度高等优良特性,是造林的先锋树种。广西是我国马尾松重要产区,南方年降水量充足但降雨量分布不均匀,且伴有多发季节性干旱。随着全球气候的变暖,这一情况愈发严重,不仅加剧了生境的恶化,更严重威胁马尾松生长,制约马尾松产业的发展。目前探究马尾松在响应干旱胁迫的生理及分子机理方面已取得一定研究进展,但从分子层面分析马尾松相关转录因子参与抗旱的机制鲜见报道。为此,本研究以前期评价的马尾松二代抗旱家系19-220和干旱敏感家系19-214作为实验材料,以前期转录组数据为基础,对马尾松WRKY、MYB、AP2/ERF等3个抗旱相关转录因子家族基因进行鉴定,并结合前期干旱转录组结果选取4个PmWRKYs基因、5个Pm MYBs基因、9个Pm AP2/ERFs基因,分析基因在组织特异性、外源激素处理及干旱胁迫下的表达模式,并对PmWRKY31响应干旱的功能进行验证。本论文将为深入研究马尾松WRKY、MYB、AP2/ERF家族基因参与干旱胁迫的分子功能奠定基础。主要研究结果如下:(1)以马尾松抗旱家系19-220和干旱敏感家系19-214半年生幼苗为实验材料,进行不同浓度外源激素SA、Me JA和ABA处理,其中喷施10 m L于地上部分(茎和针叶)、10 m L于地下部分(根),连续喷施4 d,随后补水进行干旱胁迫,以筛选提高马尾松抗旱性的外源SA、Me JA、ABA适宜浓度。通过分析表型变化、苗高增长率等指标,确定50 mg/L SA、0.5 mmol/L Me JA、25 mg/L ABA是提高半年生马尾松抗旱性的最佳激素和浓度。(2)利用生物信息学软件从转录组数据中共鉴定获得43个马尾松PmWRKYs基因、86个Pm MYBs基因、124个Pm AP2/ERFs基因,对各基因家族的核酸序列及编码蛋白等进行生物信息学分析,并对3个基因家族进行进化树分类,PmWRKYs分为7个亚家族,Pm R2R3-MYBs分为21个亚家族,Pm AP2/ERFs分为12个亚家族;同时发现各基因均具有其特征保守结构域。结果表明各基因家族在基因结构、保守结构域等都具有较高的相似性和保守性。(3)选取代表性的4个PmWRKYs基因、5个Pm MYBs基因、9个Pm AP2/ERFs基因,分析基因在不同组织中的表达特异性。结果显示,18个基因在各组织中均有表达,其中PmWRKY10、PmWRKY22、Pm MYB55、Pm MYB57、Pm AP2/ERF14、Pm AP2/ERF44、Pm AP2/ERF49、Pm AP2/ERF109基因和Pm MYB34、Pm AP2/ERF11、Pm AP2/ERF46、Pm AP2/ERF80、Pm AP2/ERF96基因分别在两个家系的根和叶中表达最高,上述基因可能参与调控根或叶来响应干旱胁迫。(4)以不同抗旱型家系半年生幼苗为实验材料,进行50 mg/L SA、0.5 mmol/L Me JA、25 mg/L ABA外源激素处理及干旱胁迫实验,利用荧光定量PCR技术对基因在激素处理和干旱胁迫下的表达模式进行分析。结果显示,18个基因在干旱处理下表达均发生变化,但表达模式不同。大部分基因在胁迫后上调表达,为正向调控干旱胁迫;而PmWRKY22基因和Pm AP2/ERF96基因在干旱后下调表达,为负向调控基因。使用外源激素SA、Me JA、ABA处理,在干旱胁迫下发现PmWRKYs、Pm MYBs、Pm AP2/ERFs基因表达模式存在差异,各基因至少响应一种外源激素诱导在干旱胁迫下表达上调。综合分析PmWRKYs的PmWRKY6和PmWRKY30基因,5个Pm MYBs基因,Pm AP2/ERFs基因中Pm AP2/ERF11、Pm AP2/ERF44、Pm AP2/ERF77和Pm AP2/ERF80基因受3种激素显著诱导,推测基因可能与激素信号转导的应答干旱胁迫途径有关,同时存在激素处理后基因表达低于CK2的情况。因此,推测PmWRKYs、Pm MYBs、Pm AP2/ERFs基因可能正向或负向调控相应的信号转导途径,进而提高马尾松的抗旱性。(5)PmWRKY31基因过量表达烟草实验结果显示,在干旱胁迫下,转基因烟草耐旱性显著高于野生型烟草,且转基因烟草丙二醛含量显著低于野生型,脯氨酸积累量高于野生型;PmWRKY31基因提高了抗旱相关基因的表达,初步验证了马尾松PmWRKY31基因的功能。
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